Nach 27 Tagen nach Beginn der hepatischen Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern PBS pro Well. Bereiten Sie die Enzymlösung in ADS-Puffer mit den angegebenen Komponenten vor. Fügen Sie einen Milliliter Lösung pro Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen hinzu.
Stellen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für etwa zwei Stunden auf einen rotierenden Shaker, um die Zellen von der Platte zu lösen. Bestätigen Sie die Zellablösung unter einem Mikroskop, pipettieren Sie dann die Zellsuspension, um sie in einzelne Zellen zu zerstreuen, und sammeln Sie sie in einem 50-Milliliter-Röhrchen, das das Hepatozyten-Reifungsmedium enthält. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 g fünf Minuten lang bei 18 Grad Celsius.
Entfernen Sie mit einem Aspirator den Überstand. Um die Mitochondrien der Zellen zu färben, resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern Hepatozyten-Reifungsmedium mit 100 nanomolaren TMRM. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und schützen Sie sie dabei vor Licht.
Zentrifugieren Sie erneut die Zellsuspension und resuspendieren Sie das Pellet in ein bis fünf Millilitern kaltem ADS-Puffer mit 2 % FBS. Nach der Zellzählung aliquotieren Sie 500.000 Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und markieren es als keine primäre Antikörperkontrolle. Die restliche Zellsuspension wird fünf Minuten lang bei 200 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand entfernt.
Fügen Sie 100 Mikroliter verdünnten Primärantikörper pro eine Million Zellen hinzu. Die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen und 50 Minuten auf Eis inkubieren. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellsuspension und waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem ADS-Puffer, der 2 % FBS enthält.
Geben Sie nun 100 Mikroliter verdünnten Sekundärantikörper pro eine Million Zellen zum Primärantikörper, gefärbten oder ungefärbten Zellen, und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension erneut und waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem ADS-Puffer, der 2 % FBS enthält. Nachdem Sie die Zellen in ADS-Puffer resuspendiert haben, filtrieren Sie sie durch ein Schnappkappen-Zellsieb und legen Sie das Röhrchen auf Eis.
