Ordnen Sie zunächst alle Materialien, die für die Passage von humanen Darmenteroiden (HIEs) erforderlich sind, auf der Arbeitsplattform an. Mischen Sie die HIEs mit einer wachstumsfaktorreduzierten 3D-Kulturmatrix. Die Mischung mit drei Tröpfchen à 10 Mikrolitern 3D-Kulturmatrix pro Vertiefung auf eine 24-Well-Platte säen und 20 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Fügen Sie dann 350 Mikroliter des HIE-Wachstumsmediums hinzu. Sammeln Sie nach sieben Tagen HIEs aus vier Vertiefungen in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die HIEs bei 2000 g für 40 Sekunden, um den Schmutz zu entfernen.
Entfernen Sie mit einer Pipette die überschüssige 3D-Kulturmatrix aus dem Röhrchen. Geben Sie 0,5 Milliliter kaltes PBS in das Röhrchen. Wenden Sie mit einer Ein-Milliliter-Insulinspritze bis zu 10 Mal physikalische Turbulenzen an, um die HIEs zu dissoziieren.
Die dissoziierten HIEs bei 2000 g werden 40 Sekunden lang zentrifugiert und der Überstand vorsichtig entfernt. Legen Sie dann das Rohr für etwa drei Minuten auf Eis. Geben Sie die wachstumsfaktorreduzierte 3D-Kulturmatrix in das Röhrchen und mischen Sie sie mit dem Pellet.
Säen Sie die Mischung der HIEs in der 3D-Kulturmatrix in der Mitte einer 35 Millimeter großen runden Schale. Inkubieren Sie die Schale 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die 3D-Kulturmatrix zu verfestigen. Geben Sie dann zwei Milliliter vorgewärmtes Darmorganoid-Wachstumsmedium in die Schale und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 48 Stunden.
Ersetzen Sie am dritten Tag das Wachstumsmedium durch zwei Milliliter vorgewärmtes Differenzierungsmedium und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 48 Stunden. Ersetzen Sie am fünften Tag das enteroide Medium durch zwei Milliliter vorgewärmtes Differenzierungsmedium und setzen Sie die Inkubation für 24 Stunden fort.
