Fügen Sie zunächst einer PBS-Lösung 500x orangefarbenen Farbstoff hinzu, um unterschiedliche Farbstoffverhältnisse zu erzielen, und starten Sie die Datenerfassungssoftware auf dem Desktop. Klicken Sie auf Instrument, wählen Sie dann das entsprechende Mikroplattenmodell aus und wählen Sie OK. Klicken Sie auf die Aufnahmeeinstellungen und wählen Sie Fluoreszenz.
Stellen Sie unter der Wellenlängenschnittstelle den Lambda-Wert auf 470 Nanometer und 570 Nanometer ein, und drücken Sie dann OK. Pipettieren Sie 100 Mikroliter jeder Konzentration des orangefarbenen Farbstoffs in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Legen Sie die Platte in den Nachweistisch des Fluoreszenz-Mikroplatten-Lesegeräts.
Klicken Sie auf das Lesesymbol in der Software und messen Sie die Fluoreszenz jedes Farbstoffs 13 Mal bei Raumtemperatur im Abstand von zwei Minuten. Klicken Sie nach jeder Bestimmung auf das Symbol Exportieren und wählen Sie dann In XML XLS TXT exportieren aus. Wählen Sie Alle Platten aus.
Wählen Sie dann Plate im Ausgabeformat aus und klicken Sie auf OK, um die Daten für die weitere Analyse im XLS-Format zu speichern. Schalten Sie nun die digitale Heizung ein, die das Trockenbad schüttelt. Stellen Sie die Heiztemperatur auf 35 Grad Celsius und die Heizzeit auf zwei Minuten ein.
Bereiten Sie das optimale Verdünnungsverhältnis des Farbstoffs in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Legen Sie es dann für zwei Minuten in das digitale Heizungs-Schüttel-Trockenbad. Geben Sie nun 100 Mikroliter PBS und die Färbelösungen in die Vertiefungen der Platte.
Setzen Sie die Platte in die Detektionsstufe des Instruments ein. Klicken Sie auf das Symbol Lesen in der Datenerfassungssoftware. Stellen Sie die Heiztemperatur auf 40 Grad Celsius und die Heizzeit auf zwei Minuten ein.
Pipettieren Sie nun die Farbstofflösung in der Platte zurück in das 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Erhitzen Sie es zwei Minuten lang im digitalen Heizungs-Schüttelbad. Wiederholen Sie die Zugabe der Farbstofflösungen, indem Sie die resultierenden Daten exportieren, um die Absorption der Farbstofflösung in Fünf-Grad-Temperaturschritten von 35 bis 95 Grad Celsius zu testen.
Kombinieren Sie CD40-Proteinlösung mit PBS, um Endkonzentrationen von 5, 10, 15 und 20 Mikrogramm pro Mikroliter zu erhalten. Kombinieren Sie anschließend orangefarbenen Farbstoff mit PBS, um eine Endkonzentration von eins bis 500 zu erhalten. Beurteilen Sie die Absorption der CD40-Proteinlösung in Fünf-Grad-Schritten von 35 bis 95 Grad Celsius.
Speichern Sie die Daten als XLS-Dateien und berechnen Sie dann den Schmelzpunkt oder TM-Wert mit der Datenanalysesoftware. Mischen Sie als nächstes CD40 und Umbelliferon in die PBS-Lösung. Pipettieren Sie dann den orangefarbenen Farbstoff in das PBS, um eine Lösungskonzentration von eins bis 500 zu erhalten.
Messen Sie die Absorption der CD40-Lösung für Umbelliferon-Komplexe in Fünf-Grad-Schritten von 35 bis 95 Grad Celsius. Der orangefarbene Farbstoff zeigte sowohl bei Raumtemperatur als auch bei erhöhten Temperaturen durchweg eine stabile Fluoreszenzanregung. Es wurde ein optimales Verdünnungsverhältnis von eins bis 500 ermittelt.
Bei einer Konzentration von 15 Mikrogramm pro Milliliter war ein stabiler TM-Wert von 51,82 Grad Celsius nachweisbar, der mit einem Anstieg der CD40-Proteinkonzentration auf 45,79 Grad Celsius abnahm.
