Visualisierung der DNA-Hybride mittels Chemilumineszenz zum Nachweis von Leptospiren in Wasserproben

Übertragen Sie zunächst die PCR-amplifizierten Proben auf eine Nylonmembran und hybridisieren Sie sie mit der Sonde. Waschen Sie die Membran zweimal mit zweimal SSPE, gemischt mit 0,1% SDS bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann inkubieren Sie die Membran mit fünffachem SSPE, gemischt mit 0,1 % SDS, an den Sonden und kühlen Sie sie 15 Minuten lang bei Glühtemperatur.

Waschen Sie die Membran am Ende der Inkubation mit Puffer eins und zwei für fünf bzw. 30 Minuten. Nachdem Sie die Membran einmal mit Puffer zwei gewaschen haben, fügen Sie 15 Mikroliter Anti-Digoxigenin-Antikörper hinzu und inkubieren Sie sie 45 Minuten lang. Waschen Sie die Membran zweimal in Puffer, einmal bei Raumtemperatur für 15 Minuten.

Einmal in Puffer drei bei Raumtemperatur fünf Minuten waschen. Fügen Sie dann gebrauchsfertiges CSPD hinzu und lassen Sie es fünf Minuten lang einwirken. Legen Sie danach die Membran in eine durchsichtige Plastiktüte und inkubieren Sie die Membran 15 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius.

Trocknen Sie anschließend die Plastiktüte und befestigen Sie sie mit Klebeband auf einer bereits verwendeten Röntgenplatte. Platzieren Sie zur Detektion die fixierte Membran vorsichtig gegenüber einer neuen Röntgenplatte im Dunkeln und legen Sie sie in eine Röntgenkassette ein. Registrieren Sie die Expositionszeit.

Der Punkt A7 zeigt, dass Leptospiral-DNA auf der Oberfläche von Teich drei vorhanden war. Das Sondensignal kann leicht bis zu 3,91 mal 10 bis zu den negativen ersten Nanogramm des Leptospira-DNA-Mixes nachgewiesen werden.