Beginnen Sie mit der Präparierung des Hippocampus aus einem embryonalen Mausgehirn und legen Sie das präparierte Gewebe in eiskalten kalzium- und magnesiumfreien Puffer oder CMF. Entfernen Sie anschließend den CMF und spülen Sie das Tuch viermal mit frischem, kaltem CMF aus, wobei Sie den Schlauch zwischen den Spülgängen vorsichtig schwenken. Fügen Sie dann gefilterte 0,125%ige Trypsinlösung hinzu und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und schwenken Sie sie alle fünf Minuten.
Nach der Inkubation die Trypsinlösung entfernen und zweimal mit eiskaltem CMF waschen. Fügen Sie dann drei Milliliter Trypsin-Inaktivierungslösung hinzu. Um die Zellen zu dissoziieren, titrieren Sie anschließend 30 Mal mit zwei Sekunden Zügen mit einer 14-Gauge-Nadel, die an einer Drei-Milliliter-Spritze befestigt ist.
Setzen Sie die Titration mit zwei zweiten Zügen 30 Mal mit einer 15-Gauge-Nadel fort, dann 20 Mal mit einer 16-Gauge-Nadel, gefolgt von 20 Mal mit einer 18-Gauge-Nadel. Führen Sie dann 15 Mal drei Sekunden lange Ziehungen mit einer 21-Gauge-Nadel durch, um die Zelldissoziation abzuschließen. Überprüfen Sie, ob Zellklumpen vorhanden sind, indem Sie ein Tröpfchen der Zellsuspension auf einen Objektträger legen.
Als nächstes filtrieren Sie fünf Milliliter FBS mit einem 0,22-Mikron-Spritzenfilter. Schichten Sie die Zellsuspension vorsichtig in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen auf das FBS. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Entfernen Sie FBS und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter warmem, antibiotikafreiem, antibiotikafreiem neurobasalem Medium. Verdünnen Sie die Zellsuspension in 0,4 % Trypanblau und erhalten Sie eine Zellzahl. Plattieren Sie die Zellen mit 750 Mikrolitern antibiotikafreiem neurobasalem Medium in einem vorgewärmten Poly-D-Lysin-beschichteten 4-Well-Kammerobjektträger.
Inkubieren Sie die Zellen in einer feuchtigkeitskontrollierten Kammer bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.
