Zu Beginn der Kultivierung fünfmal 10 bis zur fünften DF-1-Zellen pro Well in einer Sechs-Well-Platte mit DMEM, ergänzt mit 10 % FBS. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen, verwerfen Sie das Serum, das das Zellkulturmedium enthält. Nachdem Sie die Zellen dreimal mit PBS gewaschen haben, fügen Sie zwei Milliliter serumfreies Zellkulturmedium hinzu, gefolgt von einer IBDV-Viruslösung in jede Vertiefung.
Waschen Sie die Zellen nach einer Stunde Virusabsorption dreimal mit PBS und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang mit zwei Millilitern DMEM, ergänzt mit 2 % FBS. Fügen Sie 500 Mikroliter Trypsin pro Vertiefung hinzu, gefolgt von zwei Millilitern DMEM mit 10 % FBS nach einer Minute. Zentrifugieren Sie die Zellen und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
Nachdem Sie das Zellpellet in PBS resuspendiert haben, wirbeln Sie das Röhrchen drei Sekunden lang vorsichtig und zentrifugieren Sie die Zellen wie zuvor beschrieben. Zählen Sie mit einem Hämozytometer unter einem Mikroskop die Zellen, um sie in einem geeigneten Volumen des Durchflusszytometrie-Färbepuffers wieder zu suspendieren und die Suspension zu wirbeln. Geben Sie 100 Mikroliter der einzelligen Suspension in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden.
Inkubieren Sie die IBDV-infizierten Zellen und Scheinkontrollzellen mit einem Mikrogramm des entsprechenden Antikörpers 30 Minuten lang im Dunkeln auf Eis. Den Schlauch alle 10 Minuten sanft vortexen. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter Durchflusszytometrie-Färbepuffer und zentrifugieren Sie das Röhrchen.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Durchflusszytometrie-Färbepuffer. Dann inkubieren Sie die Zellen mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodid für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Und fügen Sie 400 Mikroliter Durchflusszytometrie-Färbepuffer für den Durchflusszytometrie-Assay hinzu.
Führen Sie eine Durchflusszytometrie mit dem blinden Kontrollröhrchen durch, gefolgt von den einzelnen gefärbten Röhrchen, um die Spannung und die Kompensationsparameter einzustellen, bevor Sie alle Proben laufen lassen. Die Durchflusszytometrie zeigte, dass eine beträchtliche Anzahl von Zellen nach einer IBV-Infektion positiv für N-terminale Fragmente von Hühnergasdermin E war, während die C-terminalen Fragmente von gespaltenem Hühnergasdermin E durch Durchflusszytometrie mittels Membranoberflächenantigenfärbung kaum nachweisbar waren. Die Population von N-terminalen Fragmenten von doppelt positiven Zellen aus Hühner-Gasdermin E und Propidiumiodid in IBDV-infizierten Zellen war signifikant größer als die von scheininfizierten Kontrollen, was darauf hindeutet, dass dieser Teil der IBDV-infizierten Zellen einer Pyroptose unterzogen wurde.
