Bereiten Sie zunächst die Selenoproteinlösung mit einem thermischen Shift-Assay oder TSA-Puffer vor. Geben Sie das Protein, die kleinen Moleküle und den SYPRO Orange-Farbstoff in die entsprechenden Vertiefungen einer 384-Well-Platte. Decken Sie die Platte mit optisch klarer Klebefolie ab und schleudern Sie die Platte bei 1.000 g für eine Minute in einer Zentrifuge kurz herunter.
Legen Sie dann die Platte in ein Echtzeit-PCR-Gerät und programmieren Sie sie so, dass sie die Probe zwei Minuten lang bei 20 Grad Celsius hält, gefolgt von einem Temperaturanstieg von 0,5 Grad pro Minute auf bis zu 95 Grad Celsius. Exportieren Sie die Daten aus dem RT-PCR-Gerät für relative Fluoreszenzeinheiten oder RFU in Bezug auf die Temperatur. Extrahieren und plotten Sie mit der Software Ihrer Wahl Datenpunkte bis zur höchsten Intensität, die für jede Schmelzkurve gemessen wird.
Bestimmen Sie die Schmelztemperatur mit der Boltzmann-Sigmoidalanpassung für die Daten zur Bestimmung der Schmelztemperatur oder Tm. Die thermischen Denaturierungskurven zeigten einen Anstieg der thermischen Stabilität von Escherichia coli SelO um vier Grad Celsius in Gegenwart von ATP mit Magnesiumionen und einen Anstieg um 12 Grad Celsius für ATP mit Manganionen. Es gab jedoch keine Verschiebung der thermischen Stabilität nach der Inkubation mit UTP, was darauf hindeutet, dass Escherichia coli SelO möglicherweise keine nachweisbare Bindung an UTP zeigt. Sowohl die No-Protein- als auch die No-Dye-Kontrollen hatten ein niedriges Fluoreszenzsignal, das nicht auf den Temperaturanstieg reagierte.
