Aufbereitung von Vollblutproben für die Durchflusszytometrie und Zytokinanalyse zur Bestimmung der antigenspezifischen Wirtsimmunität gegen pilzliche und virale Krankheitserreger

Um mit der Probenvorbereitung für die Durchflusszytometrie zu beginnen, entnehmen Sie Stimulationsröhrchen mit Vollblutproben mit Brefeldin A aus dem Inkubator. Geben Sie 500 Mikroliter 0,5 molare EDTA-Lösung in jedes Stimulationsröhrchen, das Brefeldin A enthält. Übertragen Sie die Proben in neue 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie dann einen Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer in jedes Stimulationsröhrchen, um es zu spülen.

Übertragen Sie den Puffer und die Zellsuspension in dasselbe Zentrifugenröhrchen. Die Röhrchen werden bei 600 g sieben Minuten lang zentrifugiert und der Überstand vorsichtig pipettiert. Geben Sie dann Erythrozyten-Lysepuffer zum Pellet und resuspendieren Sie es.

Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur, bis die Proben klar erscheinen, oder für maximal sechs Minuten. Die Röhrchen bei 600 g sieben Minuten lang zentrifugieren. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie dem Pellet einen Milliliter HBSS hinzu.

Die Zellsuspension wird in zwei Milliliter Reaktionsröhrchen überführt. Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie eine durchflusszytometrische Färbung durchführen.

Übertragen Sie die Proben aus den Stimulationsröhrchen, die kein Brefeldin A enthalten, in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Die Röhrchen bei 2.000 g 20 Minuten zentrifugieren. Pipettieren Sie nun den Überstand vorsichtig in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Wenn der Überstand nicht sofort analysiert wird, kryokonservieren Sie die Probe bei 80 Grad Celsius. Bei der Verwendung von gefrorenen Proben werden die Überstände vor der Analyse fünf Minuten lang erneut mit einer Geschwindigkeit von mehr als 7.000 g aufgetaut. Führen Sie eine Vorverdünnung der Proben durch, wie es für das Zytokin-Assay-Protokoll erforderlich ist.

Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter RNA-Schutzpuffer. Kryokonservieren Sie es bei 80 Grad Celsius für die anschließende RNA-Isolierung. Alternativ können Sie das Zellpellet in 700 Mikrolitern Lysepuffer resuspendieren, um eine sofortige RNA-Isolierung zu erhalten.