Zu Beginn betten Sie die transgene Larve in niedrigschmelzende Agarose in eine Mikrotiterschale mit Glasboden ein. Stellen Sie die Schale am inversen Mikroskop auf den mikroskopischen Tisch. Positionieren und fokussieren Sie den gewünschten Bereich für die Ablation in der Mitte des Sichtfelds.
Wählen Sie die Z-Stapel-Einstellungen aus, um die gesamte Breite des Operkels abzubilden. Bilden Sie den interessierenden Bereich des Operkels vor der Ablation ab. Zeichnen Sie dann einen kreisförmigen Bereich mit einem Durchmesser von 25 Mikrometern in einer ausgewählten 2D-Ebene.
Konzentrieren Sie sich auf das Operkel mit dem ROI-Tool (Region of Interest). Um die Ablation durchzuführen, wenden Sie die ohne Objektiv gemessene Ablationsleistung für eine Dauer von 10 Sekunden auf 450 Milliwatt an. Belichten Sie den ausgewählten Bereich mit dem Zwei-Photonen-Laser.
Bestätigen Sie nach der Ablation die Ablation strukturell, indem Sie denselben Z-Stapel mit denselben Einstellungen abbilden, die vor der Ablation verwendet wurden. Mit einer Pinzette oder einer Präpariernadel die Larven vorsichtig aus der niedrigschmelzenden Agarose entfernen. Entfernen Sie zunächst eine Schicht Agarose, die die Larven bedeckt.
Zweitens entfernen Sie die Agarose, die in direktem Kontakt mit den Larven steht. Legen Sie die Larven zurück in eine Schale mit reinem E3-Medium. Vier oder sechs Stunden nach der Läsion ist das Operkelgebiet mit in Agarose eingebetteten Larven mit den gleichen Einstellungen am selben Mikroskop erneut abzubilden.
Nachdem Sie die Bilder in Fidschi verarbeitet haben, quantifizieren Sie die Zellen mit einer Kernmarkierung oder messen Sie die Fläche, falls sich die Zellen überlappen. Um die Fläche zu quantifizieren, erstellen Sie eine Maske, die die Makrophagen umfasst. Verwenden Sie das Werkzeug Bild, Anpassen, Schwellenwert, Erstellen eines ROI und Analysieren der Partikel.
Messen Sie dann die Fläche. Erstellen Sie Diagramme, die die Messergebnisse mit geeigneter Software darstellen. Eine signifikante Akkumulation von Makrophagen in der ablierten Operkelregion wurde sechs Stunden nach der Ablation bei Larven sechs Tage nach der Befruchtung festgestellt.
Bei Larven vier Tage nach der Befruchtung stieg die Anzahl der Makrophagen vier Stunden nach der Läsion an. Die Anzahl und Fläche der Makrophagen nahm vier Stunden nach der Läsion im Vergleich zum nicht ablierten Zustand zu.
