Konfokale Mikroskopie von Zielproteinen zur Untersuchung der plasmosdermalen Lokalisation in agroinfiltrierten Pflanzen

Zu Beginn besorgen Sie sich die Pflanze Nicotiana benthamiana, die mit den Zellen des Agrobacterium tumefaciens infiltriert ist, die die gewünschten Vektoren beherbergen. Für Studien zur Proteinlokalisierung ernten Sie zwei Blätter von zwei Pflanzen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infiltration. Schneiden Sie die Infiltrationszone mit einer Klinge in Scheiben von der Vene weg.

Legen Sie die Gewebeprobe mit der abaxialen Seite nach oben auf einen Tropfen steriles Wasser in der Mitte eines Objektträgers. Decken Sie die Rutsche mit einem Deckglas ab, um sicherzustellen, dass keine Blasen eingeschlossen werden. Visualisieren Sie das Fluoreszenzsignal von autofluoreszierenden Tags im infiltrierten Bereich mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop.

Sammeln Sie 20 Bilder für jede Erkrankung mit mindestens zwei unabhängigen biologischen Replikaten. Bewerten Sie die plasmosmodesmale Lokalisation des getesteten Proteins basierend auf dem diagnostischen punktförmigen Auftreten des Signals an der Zellperipherie. TVCV MP-EGFP und PDL5-EGFP Proteine zeigten eine klare punktuelle Lokalisation zu Plasmodesmen.

Während PDCB1-EGFP am ersten Tag nach der Infiltration eine Lokalisation sowohl in den Plasmodesmen als auch im endoplasmatischen Retikulum zeigte. Sowohl MP als auch PDLP5 begannen sich am ersten Tag nach der Infiltration an den Plasmodesmen zu akkumulieren, erreichten am zweiten Tag die maximale Intensität und blieben fünf Tage lang stabil. PDCB1 zeigte bis zum dritten Tag eine starke Lokalisation des endoplasmatischen Retikulums, danach wurde die plasmasmodesmale Lokalisation in weniger Zellen sichtbar.