Um Makrophagen aus dem Knochenmark von adulten Wildtyp-Mäusen zu gewinnen, werden die Knochenmarkzellen in eine optisch behandelte 96-Well-Platte mit flachem Boden gelegt, die DMEM enthält, das mit 10 % FBS und 10 % LCCM ergänzt ist. Inkubieren Sie die Zellen 10 Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 7% Kohlendioxid. Nach der Differenzierung pipettieren Sie 75 Mikroliter der Mycobacterium abscessus-Suspension in die Makrophagen, die Vertiefungen enthalten.
Inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 7 % Kohlendioxid. Geben Sie mit einem Mikroplatten-Reagenzienspender, der mit einer kleinen Kassette ausgestattet ist, 110 Mikroliter DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 10 % LCCM, in die Verbindungen oder Lösungsmittelkontrollsäulen. Geben Sie weitere 104 Mikroliter DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 10 % LCCM, in die Säulen mit der höchsten Konzentration der Verbindung oder des Lösungsmittels.
Pipettieren Sie nun 5,9 Mikroliter der Verbindungen oder des Lösungsmittels in die dafür vorgesehenen Vertiefungen in den Säulen. Führen Sie mit einer Mehrkanal-Mikropipette zwei serielle Verdünnungen für jede Verbindung und jedes Lösungsmittel durch. Entsorgen Sie nach der letzten Verdünnung die überschüssigen 110 Mikroliter Medium aus der letzten Vertiefung.
Geben Sie 110 Mikroliter DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 10 % LCCM, in alle Säulen, mit Ausnahme von Blindvertiefungen. Bereiten Sie eine Lösung von Clarithromycin in einer Konzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter in einem DMEM vor. Nehmen Sie nach der Inkubation die 96-Well-Platte mit infizierten Makrophagen aus dem Inkubator.
Waschen Sie die Zellen mit einem Tellerwascher dreimal mit 200 Mikrolitern Infektionswaschlösung. Übertragen Sie 200 Mikroliter der Verbindungen auf die Platte, die die infizierten Makrophagen enthält. Geben Sie dann 200 Mikroliter ergänztes Zellkulturmedium und Clarithromycin-Lösung in die jeweiligen Vertiefungen.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 7 % Kohlendioxid für 48 Stunden. Waschen Sie die infizierten Zellen nach der Inkubation dreimal mit jeweils 200 Mikrolitern der Waschlösung der Verbindungen. Geben Sie mit einer Mehrkanal-Mikropipette 200 Mikroliter Fixierlösung in alle Vertiefungen und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang.
Nach dem Waschen der Zellen 200 Mikroliter durchlässige Lösung in alle Vertiefungen geben und 15 Minuten inkubieren. Aspirieren Sie anschließend die durchlässige Lösung, bevor Sie 100 Mikroliter der Färbelösung in alle Vertiefungen geben. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal mit 200 Mikrolitern der Waschlösung der Verbindung. Um die Platte mit einem High-Content-Bildgebungssystem zu screenen, wählen Sie als Plattentyp eine 96-Mikrotiter-Platte. Objektiv als 20X mit 0,4 numerischer Apertur und Modus zu Konfokal.
Wählen Sie anschließend den Kanal DAPI, CellMask deep red und mCherry aus, um das gefärbte Zellkern-, Zytoplasma- bzw. Bakteriensignal zu erfassen. Wählen Sie die Vertiefungen der Platte und die entsprechenden Felder der einzelnen Vertiefungen für die Analyse aus. Klicken Sie anschließend auf den Test und nehmen Sie ein Bild auf, um die Einstellungen zu überprüfen.
Richten Sie schließlich einen Roboter für die Gerätehandhabung ein, um die Bildaufnahme über Nacht zu automatisieren. Dieser Roboterarm tauscht die Platten im High-Content-Bildgebungssystem ohne menschliches Eingreifen aus. Die Verbindungen Daunorubicin, Doxorubicin, Thiostrepton, Epirubicin und Pyrviniumpamoat waren für die mit Mykobakterien infizierten Makrophagen toxisch, was zu einer Zelllebensfähigkeit von weniger als 85 % führte.
Die Verbindungen Moxalactam und Besifloxacin wiesen bei 13,3 Mikromolaren eine Lebensfähigkeit der Mykobakterien von weniger als 50 % auf, zeigten jedoch keinen signifikanten Unterschied zur DMSO-Kontrolle. Die Verbindungen Cefdinir, Gatifloxacin und Moxifloxacin waren mit 13,3 Mikromolaren gegen intrazelluläre Mykobakterien wirksam, wobei die Verbindung Pyrviniumpamoat am aktivsten war. Die Verbindungen Roxithromycin, Clarithromycin und Rifabutin zeigten eine extreme Wirksamkeit gegen intrazelluläre Mykobakterien, wobei Clarithromycin die Lebensfähigkeit von Mykobakterien über alle Konzentrationen hinweg auf weniger als 10 % reduzierte.
