Ich möchte Dr. Jennifer Curtiss für die Bilder in Abb. danken. 1 und Jeremy Fagan und Dr. Florence Marlow für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Unsere Arbeit wird von NIH 1R01GM088202 unterstützt.

1. Fly Kopf Dissektion <ol><li> Vergewissern Sie sich, alle Materialien zur Hand (einschließlich Gelatine beschichtete Objektträger). Bereiten Glutaraldehyd und Osmium Fixiermittel (siehe unten). Per Genotyp einzubetten, Aliquot 200 ul Glutaraldehyd fix Lösung in 1,5 ml Röhrchen auf Eis. </li><li> Anesthetize Fliegen an den CO 2-Pad (wir normalerweise sezieren sieben fliegen Köpfe auf sechs pro Genotyp einbetten bei einem Kopf während des Verfahrens wird zerstört). </li><li> Halten und leicht drücken den Brustkorb der Fliege, Rücken nach oben, mit einer Pinzette und mit einem scharfen Skalpell den Kopf abzuschlagen. </li><li> Stabilisieren Sie die Fliege Kopf durch den Hals berührend mit der Pinzette und sorgfältig abschneiden ein kleiner Teil eines Auges. Dies erhöht die Penetration der Fixierlösung (wenn Sie Ihr Auge Abschnitte für klonale Analyse verwenden möchten, schneiden Sie das Auge mit keinem oder kleinere Klone). Vermeiden Sie die Berührung und Beschädigung der intakten Auge, das später sein wird geschnitten. </li><li> Berühren Sie die Spitze mit einer Pinzette oder das Skalpell an der Oberfläche des Auges abgeschnitten und den Transfer der Kopf in Glutaraldehyd / Phosphat-Fixativ auf Eis (die Köpfe oft schwimmen auf der Fixativ) Der sezierte Köpfe sollten nicht in Glutaraldehyd Fix für länger aufbewahrt werden als 15 Minuten vor der Zugabe von Osmium. Wiederholen Sie die Schritte 1,2 bis 1,5 mit den anderen fliegt aus dem gleichen Genotyp. </li></ol> 2. Fixierung und Einbettung (Handschuhe für alle Stufen!) <ol><li> Spin the flyheads in Eppendorf-Zentrifuge für 1 Minute bei 10.000 Umdrehungen pro Minute. Weiter auch wenn Köpfe nicht sinken. </li><li> Add 200 ul von OsO 4-Lösung und fix für mindestens 30 Minuten und bis zu 1 Stunde auf Eis. </li><li> Mit einer Pasteurpipette entfernen Glutaraldehyd / Osmium-Lösung (stellen Sie sicher, um eine ordnungsgemäße Entsorgung Verfahren verwenden!) Und ersetzen mit 200 ul Osmium-Lösung. Inkubieren auf Eis für 1-6 Stunden. Achten Sie immer darauf die Köpfe vollständig mit Flüssigkeit bedeckt ist und entfernen Sie niemals die gesamte Lösung als die Köpfe oder Augen kann zusammenbrechen! </li><li> Mit einer Pasteurpipette verwerfen Fixativ, fügen 0,5-1ml 30% Ethanol und Inkubation für mindestens 5 Minuten auf dem Eis (stellen Sie sicher, um eine ordnungsgemäße Entsorgung Verfahren zu verwenden, da das Ethanol enthält nun Osmium!). </li><li> Wiederholen Sie den obigen Schritt mit 50%, 70%, (80%), 90% und zweimal 100% Ethanol. Fügen Sie die 80% Ethanol Schritt, wenn mit den Augen für elektronenmikroskopische Analyse. Nach dem 70% Waschschritt können die Proben aus dem Eis entfernt werden. </li><li> Ersetzen Sie das Ethanol mit dem gleichen Volumen von Propylenoxid (volatile, weiterhin in der Haube arbeiten). Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wiederholen Propylenoxid zu waschen. Die Arbeit in Gruppen, wenn die Verarbeitung vieler Genotypen parallel zu vermeiden Kollabieren der Augen durch Verdunstung des Propylenoxid. </li><li> Entfernen Sie die meisten der Propylenoxid und mit einem Kunststoff-Transfer Pipette etwa 500μl einer 1:1-Harz: Propylenoxid Lösung. Äquilibrieren über Nacht bei Raumtemperatur. </li></ol> 3. Embedding und Anordnung in Formen <ol><li> Stellen Sie sicher, dass alle Formen gekennzeichnet sind, um den Überblick über Ihre verschiedenen Genotypen zu halten, dann füllen Sie die Formen mit 100% Harz. Nicht überfüllen (keine &quot;hohe Hügel&quot; über die Oberfläche der Formen, wenn man gerade über der Oberfläche der Form). Verwenden von Hard-Harz für EM-Analyse. </li><li> Mit einem Transferpipette, entfernen Sie die 50% Harz aus den Köpfen, ersetzen mit 100% Harz, und inkubieren für 3-4 Stunden bei Raumtemperatur. Als Köpfe mit Harz infiltriert werden, werden sie auf den Boden des Röhrchens sinken. </li><li> Mit einem Zahnstocher, dass auf eine harte Oberfläche einmal zu einem kleinen Haken zu schaffen getroffen wurde, Transfer ein Kopf an der Zeit, in eine Form. </li><li> Legen Sie Aluminiumfolie auf der Arbeitsfläche Ihres Binokular, um es gegen Harz Verschüttungen zu schützen. </li><li> Mit einem Präpariernadel und suchen wenn Ihr Umfang, schwenken den Kopf leicht in den Harz und vorsichtig bewegen sie den Boden der Form nahe dem spitzen Ende. </li><li> Richten Sie die Oberfläche des intakten (!) Auge (oder Ihre Zukunft Schnittebene, wenn Sie Querschnitte haben wollen) Hals abwärts mit der vorderen Wand der Form, so dass Sie sicher zu halten die tangentiale Oberfläche des Auges etwa einen halben Kopf Durchmesser vom Schimmel Wand. In seltenen Fällen ein Auge zusammen, die als ein leerer Raum zwischen der Oberfläche des Auges und der Kopf Nagelhaut zu sehen ist. Wenn Sie eine zusammengebrochen Auge haben, ersetzen Sie es mit dem 7. Ersatz Auge. </li><li> Wiederholen Sie dies mit allen Köpfen. Einmal mit allen Ausrichtungen erfolgen, überprüfen Sie alle Augen zu machen, dass sie bewegte sich nicht, wenn Sie die Nadel entfernt aus dem Harz. </li><li> Wenn Sie Probleme mit den Augen bewegen, wenn Sie die Präpariernadel entfernen müssen, Position des Auges, wie gewünscht, schnell zurückziehen der Nadel ein wenig weg vom Kopf und dann langsam entfernen Sie die Nadel vollständig. </li><li> Backen Sie die Formen über Nacht bei 70 ° C. </li></ol> 4. Trimmen und Schneiden <ol><li> Entfernen gehärtete Blöcke aus den Formen durch Biegen der Formen, keeping verfolgen, welche Block entspricht dem Genotyp (zB Filiale in kleinen Szintillationsgefäße). </li><li> Zum Beschneiden, verwenden Sie ein Futter für Ihr Mikrotom das Gesicht montiert ist bis auf einen Block aus Plexiglas oder Aluminium. Montieren Sie den Block zu trimmen, Augen-up, in das Futter. </li><li> Unter der Dissektion Umfang mit einem Teflon beschichtet gestochen hieß, sorgfältig abgeschnitten nur die oberste Schicht des Blocks. Dies hinterlässt eine klare Oberfläche, durch welches man die Augen sehen sollte und kann so die Zukunft voraussagen Schnittebene. Vermeiden Sie Schnitte Ihre Finger! </li><li> Cut off überschüssige Kunststoff auf beiden Seiten des Kopfes und auf der Vorderseite (also das, was verwendet werden, um die Oberseite der Form werden bei der Ausrichtung der Augen), bis die meisten der Kunststoff um den Kopf abgeschnitten wird. Am besten ist es langsam an den Kopf abzuschneiden mehrere dünne Schichten aus Kunststoff. </li><li> Mit einem sauberen Rasierklinge vorsichtig dünne Schichten von der Spitze das Auge genau in der Ebene, die Sie weiter unten (in der Regel tangential auf das Auge, in einem leichten Winkel zur ursprünglichen Oberfläche der Form). </li><li> Fahren Sie weiter bis Sie anfangen, nur um wegschneiden der äußeren Oberfläche des Auges. Achten Sie darauf, saubere Bereiche der Klinge, um eine glänzende, transparente Oberfläche, die Ausrichtung macht in dem Mikrotom leichter zu erhalten. </li><li> Zur Einsparung von Rasierklingen, verwenden ältere Klingen für den Roh-Besatz an den Seiten des Blocks und eine frische Klinge für die feinen Trimmen (erste Schnitt und 4,6). Am Ende haben Sie eine dreiseitige Pyramide mit einem leicht geneigten, cut-off top, die Ihre Zukunft Schnittebene entspricht. </li><li> Montieren Sie den Block in das Mikrotom. Actual Schnitte ist abhängig von der Art des Mikrotoms und wird nicht im Detail beschrieben werden. Wir verwenden eine Sorvall MT5000 mit einer histo Qualität Diamantmesser auf 0,5 bis 1 &amp;mgr; Abschnitte geschnitten. Für lichtmikroskopische Analyse, nicht leichten Variationen in Schnittdicke keine Rolle. Wenn sectioning Klone von einem White + Transgen, Abschnitt markiert 1 &amp;mgr; Abschnitte, um sicherzustellen, genug Pigmentkörnchen neben der Rhabdomere pro Abschnitt (Abb. 2). </li><li> Abschnitte werden auf dem Wasser schwimmen. Heben ersten 20-30 Abschnitte mit einem abgeflachten Ende eines hölzernen Q-Tip von unterhalb der Wasseroberfläche in eine rotierende Bewegung und überführen sie in einen Tropfen Wasser auf einer Gelatine beschichteten Objektträger (gehalten auf einer Heizplatte auf etwa 100 ° C ). </li><li> Wiederholen Sie mit weitere 20-30 Abschnitten. Warten Sie, bis das Wasser verdampft ist und Abschnitte bleiben, um die Folie. Normalerweise Abschnitte 3 Augen in drei Spalten (drei Augen) durch twp Zeilen (oben / unten Abschnitte) angeordnet passen gut auf einer Folie. </li></ol> 5. Färbung und mikroskopische Analyse <ol><li> Sofern sectioning Klone, Flecken Abschnitten. Legen Sie gleiten mit Abschnitten auf einem Heizblock auf 90 ° C. Dispense Toluidine-Blau-Färbung Lösung aus einer 30 ml Spritze an einem 0,22 &amp;mgr; m-Filter auf den Objektträger und Färbung für 10 Sekunden. Sofort ausgiebig spülen mit destilliertem Wasser. Der Luft trocknen lassen. </li><li> Mit einem Kunststoff Transferpipette, verteilen 3 Tropfen DPX Eindeckmedium auf den Objektträger geben und mit einem Deckglas. Top mit 3 Groschen und lassen Sie die Eindeckmedium aushärten (zB über Nacht bei Raumtemperatur). </li><li> Bild mit einem Lichtmikroskop. Verwenden Sie ein 5x oder 10x Objektiv zu einem guten Teil zu finden und dann zu einem 63x Ölimmersion Schalter zur detaillierten Analyse und Fotografieren. Wir verwenden normalerweise Phasenkontrast-Einstellungen, aber Dunkelfeld Optik Arbeit als gut. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Am häufigsten sind die Augen aus Kunststoff für eine detaillierte Analyse der externen groben Auge Phänotypen als Teil eines genetischen Bildschirm oder in den Prozess der Erprobung genetische Interaktionen mit Genen bekannt, entweder allgemeine Struktur des Auges oder Polarität beeinflussen erkannt eingebettet. Typische Ergebnisse von Augen-Abschnitte sind in Abbildung 3 dargestellt. Wild-Typ Ommatidien (Abb. 3A) zeigen die volle Photorezeptor Ergänzung durch ein Gitter von Pigmentzellen umgeben. Im Gegensatz dazu in einem Schielen (stbm, aka van-Gogh-7) Mutante, die ommatidial Polarität verloren geht und, obwohl die volle Photorezeptor Ergänzung vorhanden ist, werden Dreh-und Chiralität randomisiert (Abb. 3B). Da außerdem die stbm Allel geschnitten in aw war - Hintergrund sind die Pigmentkörnchen in Abb. fehlt. 3B. 3C zeigt ein Beispiel für eine klonale Analyse. Drosophila Rho-Kinase (drok) für ommatidial Rotation als auch für die strukturelle Integrität des Auges 8 ist erforderlich. Homozygote drok 2 Klone durch das Fehlen von Pigment in den Pigmentzellen und die Rhabdomere (in der Regel identifiziert werden können, sind Klone induziert mit eyeless-FLP und einem P-Element mit einem stark exprimierten weiß Markergen ergänzen Hintergrund w - Mutation in der Wildnis -Typ und heterozygot Gewebe). Es ist somit möglich, Mutanten Gebieten, die durch Mangel an Pigment zu identifizieren. Aufgrund der Zell-Autonomie der Pigmentierung in der R-cells bereits erwähnt, Genotypen einzelner R-Zellen bestimmt werden kann (siehe Pfeilspitzen in Abb.. 3C) werden. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Die Drosophila Auge ist ein ausgezeichnetes Modell für Biologen, da im Gegensatz zu der glatten Oberfläche eines Wildtyp-Auge (A), wird die Oberfläche eines mutierten Auge von außen oft rauh (B), was auf der zugrunde liegenden Auge Phänotypen . In allen Figuren ist anterior der linken und dorsal wird. Bilder mit freundlicher Genehmigung von Dr. Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, NM, USA. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Lichtmikroskopische Aufnahmen einzelner Ommatidien geschnitten mit dem beschriebenen Verfahren. Nur sieben R-Zellen sichtbar sind zu einem Zeitpunkt pro Ommatidium, da R7 liegt auf der R8. (A, A &#39;) (Auf der R7 Ebene ist die Zellkörper der R7 zwischen R1 und R6 gelber Pfeil in A) festgestellt. &quot; Im Gegensatz dazu bei der R8-Ebene (B), ist die Zellkörper der R8 zwischen R1 und R2 (gelber Pfeil in B &#39;) nachgewiesen. Blaue Pfeile markieren die Pigmentkörnchen, die als Zell-autonome Pigment-Marker verwendet werden kann. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Tangential Schnitte durch Wildtyp-(A), stbm (B) und drok (C)-Mutante erwachsenen Drosophila Augen. Schematics unterhalb der Abschnitte zeigen die Polarität der Facettenaugen (siehe (A) für Pfeile). Kreise repräsentieren Ommatidien mit Defekten in der Photorezeptor ergänzen. Gelbe Linien repräsentieren die dorsal / ventral Symmetrielinie (Äquator). Im Gegensatz zu den gut orientierten Facettenaugen von Wildtyp-(A) ist die planare Organisation in der stbm Mutante (B) verloren. Beachten Sie, dass der Abschnitt der stbm Mutanten gezeigt farblos ist aufgrund seiner w - Mutanten Hintergrund. (C) Weil drok Mutationen tödlich sind, müssen sie in Klone analysiert werden. So sind pigmentierte Zellen Wildtyp-oder heterozygot (blaue Pfeile), während R-Zellen ohne Pigment (offene blaue Pfeile) homozygote Mutante. Neben Rotation Mängel, drok Mutanten zeigen auch strukturelle Defekte wie fehlende oder überschüssige Anzahl von R-Zellen. Beachten Sie, dass für die klonale Analyse, die Abschnitte nicht gefärbt werden, um nicht zu verdecken die Pigmentkörnchen.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Mit Drosophila als Modellorganismus, genetische Screens führten zur Identifizierung von vielen zu den Gründungsmitgliedern von Genfamilien essentiell für die meisten der hoch konservierten Signalwegen in höheren Eukaryonten einschließlich des Menschen. Da unter Laborbedingungen, ist eine funktionelle Auge entbehrlich für das Überleben, ist das Auge besonders gut geeignet Gewebe für die Entdeckung neuer Genfunktionen und die Bewertung der genetischen Netzwerken. Ultrastrukturelle Analyse der Fliege Auge mit dem beschriebenen Verfahren führte somit zu grundlegenden Entdeckungen relevant für die Entwicklung und Krankheit. Ursprünglich war einzigen Zelle klonale Analyse unter Verwendung von X-ray induzierten Klone mit bekannten eng verbundenen Zell-autonome rezessiven Marker kombiniert. In jüngerer Zeit hat die Verfügbarkeit des FLP / FRT-System, um Klone zu erzeugen, erheblich die phänotypische Analyse der letalen Mutationen in Auge Abschnitte 6,9 erleichtert. Die Analyse der Augen-Abschnitten ist nicht zu Tangentialschnitt hier beschriebenen beschränkt. Falls gewünscht, können die Köpfe in beliebiger Orientierung in den Formen ausgerichtet werden und Querschnitte erhalten, um tiefere Schichten in den Kopf, wie die Lamina und Medulla zu studieren. Die hier beschriebene Protokoll ist somit eine vielseitige Methode zur Analyse von Auge und Kopf Strukturen Drosophila Erwachsene.

Allgemeine Ausstattung: <ul><li> Für allgemeine fliegen Tierhaltung siehe 10 </li><li> Standard Dissektionsmikroskop (zB Nikon SMZ-645 Stereo-Zoom-Mikroskop), vorzugsweise mit einem Ring Lichtquelle zu verhindern wirft einen Schatten deiner Hände. </li><li> CO 2 Fly-Pad, mit 3 mm Whatman-Papier bedeckt, um Schutz gegen Schmutz beim Präparieren bieten. </li><li> Gelatine beschichtete Objektträger: Man löst 10g Gelatine und 1g CrKSO 4 x 12 H 2 O in 1 l Wasser auf einer Heizplatte (bring fast zum Kochen bringen, dauert ca. 2 Std.). Dip gut gewaschen (Seife) und gespült (dH 2 O) gleitet in Haltern in Gelatine-Lösung und an der Luft trocknen mit Folie abgedeckt über Nacht. </li><li> Wärmeschrank (70 ° C; alte Vakuumöfen, die für Nitrocellulosefilter Trocknung verwendet wurden, sind für diesen Zweck gut geeignet). </li><li> Mikrotom in der Lage ultradünne Schnitte (0.5-1 um dicke Abschnitte), die zB mittels Elektronenmikroskopie Einrichtungen verwendet. Wir verwenden eine Sorvall MT5000 Ultramikrotom mit einem Histo Qualität Diamantmesser. Glass Messer auch funktionieren. </li></ul> Fixation Lösungen: <ul><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 0,2 M Natriumphosphat, pH 7,2. </li><li> Bereiten Sie 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2 (bei 4 ° C für 4 Wochen gelagert werden). Machen Sie zumindest genug, um 200 ul pro Genotyp Sie einbetten möchten haben. Keep on ice. </li><li> Osmium-Lösung: 2% OsO 4 in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,2. Machen Sie nur genug, um 200 ul pro Genotyp Sie einbetten möchten haben, da die Lösung nicht gespeichert werden können. Keep on ice. </li></ul> Glutaraldehyd und OsO 4 sind sehr giftig und sollte mit äußerster Vorsicht in einen gut belüfteten Haube behandelt werden. Verwenden Sie Filter Tips beim Umgang mit OsO 4 zu verhindern, Schwärzung der Pipette. Dehydration: Stellen Sie 30%, 50%, 70%, (80%), 90% und 100% Ethanol. Vorzugsweise kühl 30%, 50%, 70% Ethanol auf Eis vor dem Gebrauch. Färbelösung: 1% Toluidine-Blau in 1% Borax. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> Weich </th><th> Schwer </th></tr><tr><td> Harz A </td><td> 54g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> Härter B </td><td> 44.5g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> Accelerator C </td><td> 2.5g </td><td> 1.75g </td></tr><tr><td> Weichmacher D </td><td> 10g </td><td> 0.75g </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Harzzubereitung Um das Harz herzustellen, sorgfältig, aber gründlich mischen Sie alle Zutaten in einen Plastikbecher mit einem Magnetrührer mit großer Rührstab. Vermeiden Sie Luftblasen. Nach dem Mischen Aliquot in Standard-Szintillationsgefäße oder ähnlichen Behältnissen und bei -20 ° C. Benutzen Sie ein weiches Harz für alle Anwendungen, wenn Ihr EM-Anlage fragt nach dem härteren Formulierung. Benutzen Sie Handschuhe, um Harz Griff (krebserregend in ihrer polymerisierten Form). Um Harz auf Geräten und Abfällen polymerisieren, backen bei 70 ° C über Nacht. Abfälle dürfen dann sicher entsorgt werden und Geräte gereinigt und wiederverwendet werden. Verschüttete polymerisierten Harz kann mit Isopropanol gereinigt werden. <table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Lieferant </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Fly-Pad </td><td> zB Genesee </td><td> 59-119 </td></tr><tr><td> Glutaraldehyd </td><td> Sigma </td><td> G7526-10 X 10 ML </td></tr><tr><td> OsO 4 </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 0972A-20 </td></tr><tr><td> Propylenoxid </td><td> Fischer </td><td> 04332-1 </td></tr><tr><td> Skalpellgriffe, für # 3 </td><td> Fischer </td><td> 22080046 </td></tr><tr><td> Skalpellklingen Nr. 11 </td><td> Fischer </td><td> 08 bis 916-5B </td></tr><tr><td> Transferpipetten </td><td> Fischer </td><td> 13 bis 711-7M </td></tr><tr><td> Durcupan (R) ACM Harz </td><td> Sigma (Fluka) </td><td> 44610-1EA </td></tr><tr><td> Stahl Präpariernadel </td><td> Fischer </td><td> S17346 </td></tr><tr><td> BEEM flachen Einbettform </td><td> Electron Microscopy Sci. </td><td> 70904-12 </td></tr><tr><td> Teflon beschichteten Klingen </td><td> Electron Microscopy Sci. </td><td> 71970 </td></tr><tr><td> Q-Tip (sterile Tupfer) </td><td> Fischer </td><td> 14-959-81 </td></tr><tr><td> Glasobjektträger </td><td> Fischer </td><td> 12-550-143 </td></tr><tr><td> Deckgläser Nr. 1, 22X60 mm </td><td> Fischer </td><td> 12-531k </td></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Fischer </td><td> ICN96010280 </td></tr><tr><td> Cr (III) K SO 4 Dodecahydrat </td><td> Sigma </td><td> 243361 </td></tr><tr><td> Diamant-Histo Messer, 6mm </td><td> Diatome US </td><td> 60-Seine </td></tr><tr><td> Toluidinblau O </td><td> Fischer </td><td> BP107-10 </td></tr><tr><td> Borax (Na-Tetraborat) </td><td> Fischer </td><td> AC20629-1000 </td></tr><tr><td> DPX Eindeckmedium </td><td> Sigma </td><td> 44581-100ML </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Materialien

preparation of adult drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis

Drosophila ist seit langem als Modellsystem verwendet worden, um Entwicklung zu studieren, vor allem wegen der Leichtigkeit, mit der sie genetisch manipulierbaren. Im Laufe der Jahre haben eine Fülle von Mutanten und technischen Tricks wurden entwickelt, damit anspruchsvolle Fragen gestellt und beantwortet werden in einer angemessenen Höhe der Zeit. Fundamental Einblick in das Zusammenspiel von Bauteilen aller bekannten großen Signalwege hat in uns gewonnen und genetische Studien Drosophila. Die Fliege Auge hat sich außerordentlich gut für die Mutationsanalyse geeignet sein, da unter Laborbedingungen, fliegt ohne funktionelle Augen überleben können. Darüber hinaus ist die Oberfläche des Insekts Auge von rund 800 individuelle Einheit Augen (Facetten-oder Facettenaugen), dass eine regelmäßige, glatte Oberfläche bilden, wenn bei unter einem Binokular betrachtet komponiert. So ist es leicht zu sehen, ob eine Mutation könnte der Entwicklung des Auges oder das Wachstum von extern auf der Suche nach dem Verlust der glatten Oberfläche (&#39;rough Auge &quot;Phänotyp; Abb. 1). Beeinträchtigen oder insgesamt Auge Größe, bzw. (für Beispiele von Bildschirmen auf der Grundlage externe Auge Morphologie siehe zB 1). Nachfolgende detaillierte Analysen Auge Phänotypen benötigen Fixierung, Kunststoff eingebettet und Dünnschicht-Schnitte von erwachsenen Augen. Die Drosophila Auge entwickelt sich aus der so genannten Eye-Imaginalscheibe, eine Tüte mit Epithelzellen, und vermehren sich differenzieren in Larven-und Puppenstadium Stufen (für eine Übersicht siehe zB 2). Jedes Ommatidium besteht aus 20 Zellen, darunter acht Photorezeptoren (PR-oder R-Zellen;. Abb. 2), vier Objektiv-sezernierenden Zapfen, Pigmentzellen (&quot;Sechseck&quot; um R-Zell-Cluster) und eine Borste. R8 [Abb.; Die Photorezeptoren jedes Ommatidium, am leichtesten durch ihre lichtempfindlichen Organellen, die Rhabdomere sind in einem Trapez aus den sechs &quot;äußeren&quot; (R1-6) und zwei &quot;inneren&quot; Photorezeptoren (R7 / 8 aus organisiert identifiziert . 2] ist unter R7 und damit nur in den Abschnitten aus den tieferen Bereichen des Auges zu sehen). Das Trapez jeder Facette ist genau mit denen der Nachbarn und der gesamten ap und dorsoventral Achsen des Auges (Abb. 3A) ausgerichtet. Insbesondere die Facettenaugen der dorsalen und ventralen (schwarz und rote Pfeile jeweils) Hälften des Auges sind Spiegelbilder voneinander und entsprechen den beiden chiralen Formen während planaren Zellpolarität Signalisierung (für eine Übersicht siehe z. B. 3) etabliert. Die Methode, die semi-dünne Auge Abschnitte erzeugen (wie in Abb.. 3 dargestellt) hier beschriebene geringfügig von der ursprünglich von Tomlinson und Ready 4 beschrieben modifiziert. Es ermöglicht die morphologische Analyse aller Zellen mit Ausnahme der transparenten Kegel-Zellen. Darüber hinaus kann das Pigment der R-Zellen (blau Pfeilspitzen in Abb.. 2 und 3) als Zell-autonome Marker für den Genotyp eines R-Zelle, also genetische Voraussetzungen von Genen in einer Untergruppe von R-Zellen verwendet werden können leicht bestimmt werden 5,6.

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Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Ein Standard-Ansatz zur Erwachsenen vorbereiten<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen für semi-dünne Schnitte und leichte mikroskopische Analyse wird hier vorgestellt. Das Protokoll kann bei grober morphologische Analyse von Fehlsichtigkeiten eingesetzt werden, oder mit den angegebenen Einstellungen können verwendet werden, um genetische Voraussetzungen von Genen in bestimmten Zelltypen des Auges (zB klonale Analyse von Photorezeptoren) oder für elektronenmikroskopische Analyse zu bestimmen.

Vorbereitung von Adult Drosophila Augen für Thin Schnitte und mikroskopische Untersuchung

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

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Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

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Serie: Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Forschung

Biologie

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Dünnschnitt der Scheibe Vorbereitungen für die Immunhistochemie

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

Whole Cell Recordings von Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Hochauflösendes Video Tracking von Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissection der hippocampalen von erwachsenen Maus

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Vorbereitung von Drosophila Polytäne Chromosome Kürbisse für Antikörpermarkierung

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Vorbereitung der Drosophila S2-Zellen für Lichtmikroskopie

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...