Die Autoren bedanken sich bei Dr. Hui Zheng (Baylor College of Medicine) für die APP cDNA danken. Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), die John Sealy Memorial Endowment Fund for Biomedical Research (AFO) und der Jean C. und William D. Willis Neuroscience Research Endowment finanziert (ESS). JMB ist ein Gelehrter in der Translational Research Scholar Program und ein Mitglied der University Of Texas Medical Branch Claude E. Pfeffer Ältere Amerikaner Independence Center (unterstützt durch NIH Grants UL1RR029876 und P30-AG-024.832, jeweils).

<html> Ein. Expression von rekombinantem APP intrazelluläre Domäne (AICD) <ol><li> Transform E. coli-Stamm BL21 mit menschlichen AICD (Reste 649-695 von APP, neuronale Isoform Nummerierung) in den Vektor pGEX-4T-1 (GE Healthcare) kloniert. Dieser Vektor wird als C-terminalen Teil eines Fusionsprotein von Glutathion-S-Transferase (GST) AICD exprimieren. Dieser Vektor kodiert für ein Thrombin auch Spaltsequenz um das Entfernen des GST-Einheit zu erleichtern. Details Klonierung in pGEX-4T-1 AICD finden Sie in unserem früheren Veröffentlichung 4 gefunden werden. </li><li> Aus einer einzigen Kolonie, Animpfen von 10 ml LB-Medium mit Ampicillin (100 ug / ml) und bei 37 ° C über Nacht unter starkem Schütteln. </li><li> Am nächsten Morgen impfen 400 ml LB / Ampicillin in einem Ein-Liter-Kolben mit 5 ml der Übernacht-Kultur. </li><li> Bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm erreicht hat 0,4 bis 0,6. Dies dauert in der Regel 2 bis 2,5 Stunden. </li></ol>content &quot;&gt; An diesem Punkt kann es wünschenswert sein, um den Abschluss einer kleinen Probe (~ 10 ul), um die Reinigung durch SDS-PAGE (siehe 1A, B) zu folgen. Jede nachfolgende Reinigungsstufe sollte auch eine kleine Aliquots zur Analyse entnommen durch SDS-PAGE. <ol start="5"><li> Induzieren die Expression von GST-AICD durch Zugabe von 0,4 mM Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG). Bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln für 5 Stunden. </li><li> Zentrifugation der Zellen bei 6000 × g für 15 min bei 4 ° C. Das Zellpellet kann bei -80 ° C für mehrere Monate werden an diesem Punkt des Verfahrens abgelegt. </li></ol> 2. Reinigung von GST-AICD <ol><li> Planen 50 ml Lysepuffer wie folgt: 1 mM Dithiothreitol, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,1% Triton-X100, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Complete Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche Applied Science) und phosphatgepufferter Salzlösung. Chillen auf Eis. </li><li> Auftauen Bakterienpellet (wenn vorher eingefroren) aufEis. </li></ol> An diesem Punkt ist es wichtig, dass alle Schritte bei 4 ° C durchgeführt, um die Proteolyse zu begrenzen. Alle Rohre, Puffer und andere Reagenzien sollten vorgekühlt. Wenn Sie einen Französisch drücken oder Emulgator für die Lyse, sollten diese vorgekühlten als gut. <ol start="3"><li> Gründlich resuspendieren das Bakterienpellet in 20 ml Lyse-Puffer. Eine Kombination von Verwirbelung und Verreiben mit 10 ml Pipette auf Eis wird eine vollständige Resuspension des Pellets. </li><li> Passieren die resuspendierten Bakterienzellen durch einen Emulgator (z. B. Avestin EmulsiFlex-C3) oder Französisch Druckzelle, vorgekühlt auf 4 ° C bei 30.000 psi. Führen Sie das Lysat durch die Emulgator ein zweites Mal. Sammeln Sie das Lysat in ein vorgekühltes 50 ml Tube. </li></ol> Der Hauptvorteil dieser beiden Instrumente ist, dass sie Erwärmung der Probe zu minimieren. Die am häufigsten verwendete Technik der Ultraschallbehandlung erzeugt erhebliche Hitze an der Spitze der Sonde und der Ultraschallbehandlungkann Aggregation von rekombinanten Proteinen führen. <ol start="5"><li> Zentrifuge das Lysat bei 15000 × g für 30 min. Trennen Sie und halten Sie den Überstand in ein vorgekühltes 50 ml Tube. </li><li> Add 500 pl einer 50% igen Aufschlämmung von Glutathion-Agarose (Sigma-Aldrich). Drehen für 30 min bei 4 ° C. Während die Probe rotiert, machen frische Elutionspuffer: 50 mM Tris 7,8, 0,1% Triton-X100, 0,5 mM Dithiothreitol, 10 mM reduziertes Glutathion. </li></ol> Der einzige Schritt des Protokolls, das bei Raumtemperatur durchgeführt wird, ist der Elutionsschritt. Somit wird der Elutionspuffer bei Raumtemperatur gehalten. Elutionspuffer sollte frisch zubereitet werden. <ol start="7"><li> Gießen des Lysats und Schlamm in eine Einweg-5 &quot;Polystyrol Chromatographiesäule mit grobem (90-130 um) Filtern (Evergreen Scientific). Die Säule wird 5 mal mit 3 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. </li><li> Verschließen Sie die unteren Ende der Säule und 500 ul der Raumtemperatur Elutionspuffer. Verschließen Sie die Spitze derSäule und rotieren für 5 min bei Raumtemperatur. Sammeln des Eluats in ein gekühltes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie die Elution zwei weitere Male (1,5 ml insgesamt Eluat). </li><li> Dialysieren das Eluat in einem 10.000 Molekulargewichtsschnitt Dialysemembran (zB Thermo Scientific Slide-A-Lyzer Dialyse Kassetten) in 4 Liter phosphatgepufferter Kochsalzlösung über Nacht bei 4 ° C. Dialysieren gegen weitere 4 Liter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei 4 ° C für 1 Stunde am folgenden Tag. </li><li> Entfernen des Proteins aus der Kassette und Dialyse durchführen Proteinquantifizierung Assay zur Ausbeute von GST-AICD bestimmen. Ein typisches Reinigungsverfahren aus 400 ml Kultur werden in Ausbeuten von&gt; 20 mg gereinigtem Protein bei Konzentrationen von 10-20 mg / ml ergeben. Aliquot das Protein in 200 ul Aliquots und einfrieren bei -80 ° C. </li></ol> 3. Thrombin Spaltung von GST-AICD und Reinigung von AICD <ol><li> Thaw 200 ul des gereinigten GST-AICD und fügen Sie 20 ul 1 U / ul Thrombin. über Nacht bei 37 ° C. </li></ol> Die Qualität und Reinheit von Thrombin variiert beträchtlich zwischen den Herstellern und können eine bedeutende Quelle von Verunreinigungen sein. Wir verwenden Thrombin von GE Healthcare (siehe Tabelle von Reagenzien). Nach Inkubation über Nacht, sollte&gt; 95% des Fusionsproteins abgespalten (1B) ist. <ol start="2"><li> Nachdem über Nacht Spaltung mit Thrombin, ist es wahrscheinlich, dass eine Fraktion des freigesetzten AICD Aggregation unterzogen und die Lösung trüb erscheinen. Löschen des aggregiertes Material durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand in ein vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Fügen Sie 50 ul 50% Glutathion-Agarose-Suspension und 50 ul 50% p-Aminobenzamidin-Agarose Aufschlämmung zu GST und Thrombin zu entfernen sind. Inkubieren mit einer Drehung 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Zentrifuge kurz Sediment die Agarosekügelchen, und entfernen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen. Auszug ter GST vier weitere Male mit Glutathion-Agarose. Eine einzelne Extraktion mit p-Aminobenzamidin-Agarose ist ausreichend, um die 20 U Thrombin zu entfernen. </li><li> Führen Sie ein Protein Quantifizierung Assay auf 5 ul des gereinigten AICD. Typische Ausbeuten aus einer 400 ml Kultur sind 50-100 ug bei einer Konzentration von 0,2 bis 0,5 mg / ml. Höhere Renditen sind möglich durch Spaltung größere Mengen an GST-AICD. </li></ol> Gereinigtes AICD sollte vorbereitet biochemischen / biophysikalischen Charakterisierung frisch. Nicht verwendetes Material muss verworfen werden. Es ist auch möglich, die durch Lyophilisieren der AICD Probe und Resuspendieren in einem kleineren Volumen an Puffer 6 konzentrieren. Wenn Erfassen AICD erfordert Blotting (wie nach einer Filtereinheit oder Dot-Blot-Assay), Antigen Retrieval auf der Membran durchgeführt werden sollte, wie durch Pimplikar und Suryanarayana 12 beschrieben. 4. AICD Aggregation für Atomic Force Microscopy (AFM) <ol><li> Frisch p hergestellten verdünnen AICDhosphate Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 0,1 mg / ml in einem Gesamtvolumen von 15 ul. An diesem Punkt können verschiedene Verbindungen und / oder Proteine ​​hinzugefügt zu bestimmen, ob sie AICD Aggregation hemmen. Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass äquimolare Konzentrationen von Ubiquilin-1 Aggregation AICD verhindern in diesem Assay 4. </li></ol> Es ist auch möglich, größere Aggregat Reaktionsvolumina für biochemische Experimente wie Abfangfilter Assays und Lichtstreuung 4. Wir haben erfolgreich war Durchführen Abfangfilter Assays auf Reaktionsgemische so groß wie 400 ul mit AICD auf Konzentrationen so niedrig wie 1 uM verdünnt. <ol start="2"><li> Induzieren thermische Aggregation durch Inkubation der Proben bei 43 ° C unter Schütteln bei 800 rpm in einer Eppendorf-Thermomixer für 48 Stunden. Diese Temperatur wurde auf der Grundlage Chaperon Assays, die die thermische Aggregation des Modells Chaperon Substrat Citratsynthase 4,13 untersuchen gewählt. </li></ol><p class="jove_content"&gt; Thermische Aggregation ist eine häufig verwendete Methode, um den strukturellen Übergang eines Proteins aus einem nativen veranlassen, eine nicht-native Struktur (was gewöhnlich Beta-Faltblatt-reich), was zur Bildung von intermolekularen Aggregate führt. Thermische Aggregation wird auch verwendet, um die Funktion von Chaperonen, die hydrophoben Segmente aus Bilden unangemessen intermolekulare Wechselwirkungen (und damit zu verzögern oder zu verhindern thermische Aggregation) abzuschirmen untersuchen. <ol start="3"><li> Verdünnen Sie die Probe 20-fach in deionisiertem Wasser und Spot 2 ul auf frisch gespaltenem Glimmer. Trocknen Sie die Probe in einem Exsikkator über Nacht. Es wird notwendig sein, um empirisch die optimale Verdünnung für die Bildgebung und somit mehrere Verdünnungen im Bereich von 10 - bis 100-fach wäre klug. </li><li> Visualisieren Sie die aggregierten AICD mit dem AFM Betriebssystem im Tapping-Modus 14. Die Ausleger verwendet werden, sind Gold-Mikrotabletten scharfe Nitrid Hebel (MSNL, Bruker) mit einem nominalen Spitzenradius von 2 nm. Typische Klopfen Amplituden währendten Imaging sind 10-20 nm bei der Resonanzfrequenz der Ausleger (30-50 kHz). </li></ol> Wir fanden, dass die Bildqualität und Kontrast verschiedener Proteinaggregate auf die aufgebrachte Kraft und die Dauer des Experiments abhing. Perturbation zu Probe durch die Spitze zu minimieren, behielten wir die angelegte Kraft relativ gering, indem sie einen Sollwert-Verhältnis oberhalb von 95% und die Begrenzung der Abtastung einer jeden Probe auf 5-10 min. Bildverarbeitung wurde mit WSxM Software (Nanotec) durchgeführt. Standard-Bildverarbeitungsfunktionen bestand aus dem Flugzeug Subtraktion und Abflachung. Unsere Laboratorien ein &quot;Home-built&quot; AFM 15 eine Schnittstelle zu einem kommerziellen Rastersondenmikroskop Steuerung (Nanotec). 5. Repräsentative Ergebnisse Die Expression und relative Anreicherung von GST-AICD ist in 1A gezeigt. Nach Lyse ist die Mehrheit von dem Fusionsprotein in der löslichen Fraktion und damit Extraktion aus Inclusiauf Körper ist nicht erforderlich. Das Material, aus dem Glutathion-Agarose-Säule eluiert ist&gt; 95% rein. Bei der Herstellung in 1 gezeigt, war die Konzentration des Proteins aus der Säule eluiert 14,5 mg / ml, und die Ausbeute betrug 22 mg (aus einer Startkultur von 400 ml). Spaltung von 200 ul dieses Präparats über Nacht mit 20 U Thrombin in Folge nahezu 100% Spaltung des Fusionsproteins (1B). Die Menge an Thrombin verwendet wird, ist niedrig genug, wie es nicht sein, nachweisbar durch Coomassie-Blau-Färbung (siehe &quot;Cleaved&quot; lane, Abbildung 1B). Entfernen des Thrombins und GST führte zu einem gewissen Verlust an Material, jedoch&gt; 90% rein mit einer Ausbeute in dieser prep von 70 ug AICD in einer Konzentration von 0,35 mg / ml betrug. 1C zeigt das Flußdiagramm für die Aggregation von AICD und nachfolgende Analyse. AICD Aggregate durch AFM abgebildet sind typischerweise Sphäroids / amorph und in der Größe von 50 bis 100 nm (Abb. 1D, F). AggregierteMaterial ist nicht nachweisbar, wenn eine äquimolare Menge des Chaperon Ubiquilin-1 an die Aggregations-Reaktionsvorrichtung (1E) 4 zugesetzt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4204/4204fig1.jpg" /> Abbildung 1. Aufreinigung und Aggregation von AICD. A) Coomassie-Blau-Färbung der Proben in jedem Schritt des Reinigungsverfahrens gesammelt. Für den nicht induzierten und induzierten Proben wurden 20 ul gesamten Bakterien auf der Gel laufen. Für die Überstandsfraktion wurden 5 ul Lysat (aus einem Gesamtvolumen von 20 ml) auf dem Gel laufen. Für die Pelletfraktion wurde das Pellet in 20 ml Lyse-Puffer resuspendiert und 5 ul dieses Materials wurden in einem Wasserbad Sonicator während 30 min bei 4 ° C beschallt vor dem Laden auf das Gel. Für die Durchströmung wurden 5 pl auf dem Gel laufen. Die Mengen des Eluats auf das Gel geladen sind angegeben. B) Coomassie-Blau gefärbten Gel ungespaltenen und gespaltenen GST-AICD (2 ul) und 1 und 5 &amp; mu; l gereinigte AICD. C) Flussdiagramm der AICD Reinigung, Aggregation und Analyse. D, E) Repräsentative AFM-Bild von thermisch aggregiert AICD in Abwesenheit (D) und in Gegenwart (E) des molekularen Chaperons Ubiquilin-1. F) Histogramm der Größenverteilung der AICD Aggregate.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Protokoll haben wir ein Verfahren zur Gewinnung von hochreinem AICD für strukturelle, biophysikalischen und biochemischen Analysen skizziert. Dieses Verfahren erfordert keine ausgeklügelte Chromatographie Geräte und ist damit zugänglich für die meisten Laboratorien. Andere Gruppen haben AICD 5-7,16 gereinigt, einschließlich GST-AICD 17-19, für biochemische / Strukturanalysen. Nachteile zu früheren Protokollen gehören schlechte Löslichkeit von AICD 16, weniger als idea...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> Thrombin </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> Bradford-Protein-Assay-Reagenz </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Coomassie-Blau </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> Glutathion-Agarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> p-Aminobenzamidin-Agarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> Komplette Proteaseinhibitor-Cocktail </td><td> Roche </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer Dialyse Kassetten </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66380 </td><td></td></tr><tr><td> Chromatographiesäulen </td><td> Evergreen Scientific </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> Emulgator </td><td> Avestin, Inc. </td><td> EmulsiFlex-C3 </td><td> Highly recommended </td></tr><tr><td> Eppendorf Thermomixer </td><td> Eppendorf </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> Mica Disks </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> AFM Cantilever </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM Software </td><td> Nanotec </td><td> N / A </td><td> Free Download </td></tr></tbody></table>

purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain

Amyloid-Vorläuferprotein (APP) ist ein Typ I Transmembran-Proteins mit der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit (AD) zugeordnet ist. APP wird durch einen großen extrazellulären Domäne und einer kurzen zytosolische Domäne bezeichnet das APP intrazelluläre Domäne (AICD) aufweist. Während der Reifung durch den sekretorischen Weg, kann APP durch Proteasen genannt α, β und γ-Sekretase 1 gespalten werden. Sequentielle proteolytische Spaltung von APP mit β und γ-Sekretasen führt zu der Produktion eines kleinen Peptids proteolytische, genannt Aß, das amyloidogene ist und der Kernbestandteil von senilen Plaques. Die AICD ist auch befreit von der Membran nach Sekretase Verarbeitung und durch Interaktionen mit Fe65 und Tip60 kann in den Kern in Transkriptionsregulation mehrerer Zielgene 2,3 teilzunehmen translozieren. Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen den AICD beeinträchtigen Menschenhandel, Verarbeitung und zelluläre Funktionen von Holo-APP und seine C-terminal Fragmente. Wir haben kürzlich gezeigt, dass AICD wird Aggregat kann in vitro, und dieser Prozess durch den AD-verwickelt molekularen Chaperon Ubiquilin-1 4 inhibiert. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen, die AICD hat hydrophoben Domänen ausgesetzt und ist untrennbar in vitro 5,6 ungeordnet, aber es erhält stabile sekundäre Struktur, wenn sie Fe65 7 gebunden. Wir haben vorgeschlagen, dass Ubiquilin-1 unangemessen inter-und intramolekulare Wechselwirkungen von AICD verhindert die Aggregation in vitro und in intakten Zellen 4. Während die meisten Studien über die Rolle von APP in der Pathogenese von AD zu konzentrieren, ist die Rolle in diesem Prozess AICD nicht klar. Expression AICD hat sich gezeigt, Apoptose zu induzieren 8, zu modulieren Signalwege 9 und zum Calcium regulieren Signalisierung 10. Überexpression von AICD und Fe65 in einer transgenen Mausmodell induziert wie Alzheimer Pathologie 11, und vor kurzem hat AICD in BH nachgewiesenin Lysaten mittels Western Blot, wenn mit geeigneten Antigen-Retrieval-Techniken 12. Um strukturelle, biochemische und biophysikalische Untersuchungen des AICD erleichtern, haben wir ein Verfahren zur rekombinanten große Mengen an hochreinem AICD Protein produzieren. Wir beschreiben außerdem ein Verfahren zur Induktion der in vitro thermische Aggregation AICD und Analyse mittels Rasterkraftmikroskopie. Die beschriebenen Methoden sind für biochemische, biophysikalische und strukturelle Charakterisierung des AICD und die Auswirkungen der molekularen Chaperone auf AICD Aggregation nützlich.

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Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Ein Verfahren für die großtechnische Reinigung des APP intrazelluläre Domäne (AICD) beschrieben. Wir beschreiben auch Methoden zu induzieren<em&gt; In vitro</em&gt; AICD Aggregation und Visualisierung mittels Rasterkraftmikroskopie. Die beschriebenen Methoden sind nützlich für biochemische / strukturelle Charakterisierung der AICD und die Auswirkungen der molekularen Chaperone auf die Aggregation.

Reinigung und Aggregation des Amyloid Precursor Protein intrazelluläre Domäne

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

11.7K Aufrufe.  University of Texas Medical Branch. Ein Verfahren für die großtechnische Reinigung des APP intrazelluläre Domäne (AICD) beschrieben. Wir beschreiben auch Methoden zu induzieren In vitro AICD Aggregation und Visualisierung mittels Rasterkraftmikroskopie. Die beschriebenen Methoden sind nützlich für biochemische / strukturelle Charakterisierung der AICD und die Auswirkungen der molekularen Chaperone auf die Aggregation.

Serie: Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

Durchführung und Abwicklung der FNA Anterior Fat Pad für Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Forschung

Medizin

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarker in einem Tiermodell für die Aufdeckung Neural, hämatologischen und Behavioral Korrelate der PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

Subretinale Transplantation von MACS gereinigten Photorezeptor-Vorläuferzellen in die adulte Maus-Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. Clinically, more than 50% of SCI affect the cervical spine1. As a consequence of the primary injury, a cascade of secondary mechanisms including inflammation, apoptosis, and demyelination occur finally leading to tissue scarring and development of intramedullary cavities2,3. Both represent physical and chemical barriers to cell transplantation, integration, and regeneration. Therefore, shaping the inhibitory environment and bridging cavities to create a supportive milieu for cell transplantation and regeneration is a promising therapeutic target4. Here, a contusion/compression model of cervical SCI using an aneurysm clip is described. This model is more clinically relevant than other experimental models, since complete transection or ruptures of the cord are rare. Also in comparison to the weight drop model, which in particular damage the dorsum columns, circumferential compression of the spinal cord appears advantageous. Clip closing force and duration can be adjusted to achieve different injury severity. A ring spring facilitates precise calibration and constancy of clip force. Under physiological conditions, synthetic self-assembling peptides (SAP) self-assemble into nanofibers and thus, are appealing for application in SCI5. They can be injected directly into the lesion minimizing damage to the cord. SAPs are biocompatible structures erecting scaffolds to bridge intramedullary cavities and thus, equip the damaged cord for regenerative treatments. K2(QL)6K2 (QL6) is a novel SAP introduced by Dong et al.6 In comparison to other peptides, QL6 self-assembles into &#946;-sheets at neutral pH6.14 days after SCI, after the acute stage, SAPs are injected into the center of the lesion and neural precursor cells (NPC) are injected into adjacent dorsal columns. In order to support cell survival, transplantation is combined with continuous subdural administration of growth factors by osmotic micro pumps for 7 days.

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

Synergetische Nutzung von neuralen Vorläuferzellen und Self-Montage Peptide in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&#946; and Tau Neuropathology

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. The paradigm includes tests for spontaneous alternation in a Y-maze, novel object recognition, and limb clasping. These tests were selected because they: 1) interrogate function of cognitive or motor domains and the correlate neural circuitry relevant to the human disease state, 2) have clearly defined endpoints, 3) have easily implementable quality control checks, 4) can be run in a moderate throughput format, and 5) require little intervention by the investigator. These methods are designed for investigators looking to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks, or functional motor behaviors associated with Alzheimer's disease mouse models. The methods described here use behavioral tests that engage a number of different brain regions including hippocampus and various cortical areas. Investigators that desire cognitive tests that specifically assess cognition mediated by a single brain region could use these techniques to supplement other behavioral tests.

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&amp;#946; and Tau Neuropathology

Described here is a staged, behavioral screening approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. These methods are optimized to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks.

Assessment of Spontane Alternation, neuartige Objekterkennung und Gliedmaßenverkürzung in transgenen Mausmodellen der Amyloid-β- und Tau-Neuropathologie

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or in buffer (washed platelets), by the use of one or a combination of agonists. The use of washed platelets separated from their plasma environment and in the absence of anticoagulants allows for studying intrinsic platelet properties. Among the large panel of agonists, arachidonic acid (AA), adenosine di-phosphate (ADP), thrombin and collagen are the most frequently used. The aggregation response is quantified by measuring the relative optical density (OD) over time of platelet suspension under continuous stirring. Platelets in homogeneous suspension limit the passage of light after the addition of an agonist, platelet shape change occurs producing a small transitory increase in OD. Following this initial activation step, platelet clots form gradually, allowing the passage of light through the suspension as a result of decreased OD. The aggregation process is ultimately expressed as a percentage, compared to the OD of platelet-poor plasma or buffer. Rigorous calibration is thus essential at the beginning of each experiment. As a general rule: calibration to 0% is set by measuring the OD of a non-stimulated platelet suspension while measuring the OD of the suspension medium containing no platelets represents a value of 100%. Platelet aggregation is generally visualized as a real-time aggregation curve. Turbidimetry is one of the most commonly used laboratory techniques for the investigation of platelet function and is considered as the historical gold standard and used for the development of new pharmaceutical agents aimed at inhibiting platelet aggregation. Here, we describe detailed protocols for 1) preparation of human washed platelets and 2) turbidimetric analysis of collagen-induced aggregation of human washed platelets pretreated with the food dye Brilliant Blue FCF that was recently identified as an inhibitor of Pannexin1 (Panx1) channels.

We describe a straightforward method for the isolation of washed platelets from human blood followed by agonist-induced platelet aggregation measurements by turbidimetry. As an example we apply this method for studying the aggregation response of human platelets to collagen after a pre-incubation with the Pannexin1 channel inhibitor Brilliant Blue FCF.

Turbidimetrie Menschen Gewaschene Thrombozyten: Die Wirkung des Pannexin1-Inhibitor Brilliant Blue FCF auf Collagen-induzierte Aggregation

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum (SR) serves as a Ca2+ reservoir for contraction, which reuptakes intracellular Ca2+ during relaxation. The SR Ca2+ reserve available for beats is determinate for cardiac contractibility, and the removal of intracellular Ca2+ is critical for cardiac diastolic function. Under some pathophysiological conditions, such as diabetes and heart failure, impaired calcium clearance and SR Ca2+ store in cardiomyocytes may be involved in the progress of cardiac dysfunction. Here, we describe a protocol to evaluate SRCa2+ reserve and diastolic Ca2+ removal. Briefly, a single cardiomyocyte was enzymatically isolated, and the intracellular Ca2+ fluorescence indicated by Fura-2 was recorded by a calcium imaging system. To employ caffeine for inducing total SR Ca2+ release, we preset an automatic perfusion switch program by interlinking the stimulation system and the perfusion system. Then, the mono-exponential curve fitting was used for analyzing decay time constants of calcium transients and caffeine-induced calcium pulses. Accordingly, the contribution of the SR Ca2+-ATPase (SERCA) and Na+-Ca2+ exchanger (NCX) to diastolic calcium removal was evaluated.

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Here, we describe a protocol to evaluate sarcoplasmic reticulum Ca2+ reserve and diastolic calcium removal function in cardiomyocytes by a calcium imaging system.

Bewertung der sarkoplasmatischen Retikulum Calcium Reserve und intrazellulären diastolische Calcium Entfernung in isolierten ventrikulären Kardiomyozyten

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

In Vivo Darstellung der Cx3cr1GLP/Gfp Reporter Mäuse mit Spectral-Domain optische Kohärenztomographie und Scanning Laser Ophthalmoskopie

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

Isolierung und Reinigung von murinen Herzperizyten

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Ultrazentrifugenbasierte Isolierung extrazellulärer Vesikel aus humanen ADSCs

Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research suggests that their regenerative function may be attributed to cell-cell contact and cell paracrine effects. The paracrine effect is an important way for cells to interact and transfer information over short distances, in which extracellular vesicles (EVs) play a functional role as carriers. There is significant potential for ADSC EVs in regenerative medicine. Multiple studies have reported on the effectiveness of these methods. Various methods for extracting and isolating EVs are currently described based on principles such as centrifugation, precipitation, molecular size, affinity, and microfluidics. Ultracentrifugation is regarded as the gold standard for isolating EVs. Nevertheless, a meticulous protocol to highlight precautions during ultracentrifugation is still absent. This study presents the methodology and crucial steps involved in ADSC culture, supernatant collection, and EV ultracentrifugation. However, even though ultracentrifugation is cost-effective and requires no further treatment, there are still some inevitable drawbacks, such as a low recovery rate and EV aggregation.

Autor im Rampenlicht: Standardisierung und Verbesserung der Extraktion und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus humanen ADSCs

This protocol describes all procedures, from culturing human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) and collecting supernatant to extracting extracellular vesicles (EVs) using ultracentrifugation.

Aufreinigung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus humanen mesenchymalen Stammzellen aus Fettgewebe

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research ...