KG wurde von der RA Welch Foundation Zuschuss P-1760 unterstützt, TCU Andrews Institut für Mathematik und Pädagogik der Naturwissenschaften (KG), TCU Forschung und Kreativität Aktivität Grant (KG) und TCU SERC Grant (bis JHS).

1. Synthese von Biotin-Fc-cystein (1) <ol><li> Festphasenverfahren zur Herstellung von harzgebundenen 1. <ol><li> Zeigen Biotin beladene Harz (250 mg, 0,145 mmol) in eine Fritten Spritze und quellen des Harzes durch die Aufstellung Dimethylformamid (5 ml) und Schütteln der Spritze auf einen Laborschüttler für 20 min. Vertreiben die Lösung und wiederholen Dimethylformamid Schwellungen noch einmal. </li><li> Entfernen Sie die Fmoc-Schutzgruppe durch Zugabe von 6.4 ml 20% Piperidin in Dimethylformamid mit der Spritze, gefolgt von 10-15 Minuten schütteln. Wiederholen Sie den Entschützungsverfahren mit etwa 4-6 ml Piperidin. Methanol (1: 1), 3x Methanol: Dichlormethan (1: 1) mit einer Sequenz von 3x Dimethylformamid, 3x Dimethylformamid Waschen des Harzes, 3x Dichlormethan, ~ 5 ml. Machen einen Ninhydrintest (+) auf eine kleine Proben (~ 10) der Kügelchen eine erfolgreiche Entfernung der Schutzgruppe durch die Anwesenheit von blau nach Erhitzen zu bestätigen. </li><li> Mix eine Lösung, die 1&#39;-Fmoc-amino-ferrocen-1-carbonsäure(203,3 mg, 0,4350 mmol), 1-Hydroxybenzotriazolhydrat (58,8 mg, 0,413 mmol), Diisopropylcarbodiimid (0,0673 ml, 0,435 mmol), Diisopropylethylamin (0,0757 ml, 0,435 mmol) und eine 4: 1 Mischung von Dichlormethan und Dimethylformamid. Zeichnen Sie diese in den Fritten Spritze und schütteln auf einem Laborschüttler 6 Stunden. Dann vertreiben die Lösung aus der Spritze und wasche wie früher beschrieben. </li><li> Führen Sie den Ninhydrintest (-), wie oben beschrieben, um die Kopplung zu bestätigen. Der Ninhydrin-Test immer noch nützlich für die Bestätigung Kopplungs trotz der orange Farbe der Kügelchen von der Befestigung der Eisen enthaltende Einheit abgeleitet ist. </li><li> Dann Entfernen der Fmoc-Gruppe, die durch die Zugabe von 20% igem Piperidin in Dimethylformamid und wie oben beschrieben gewaschen. Der Ninhydrin-Test (+) verwendet werden, um Fmoc Entfernen zu bestätigen. </li><li> Wird eine Lösung aus Fmoc-Cys (Trt) -OH zusammen (254,8 mg, 0,4350 mmol), 1-Hydroxybenzotriazolhydrat (58,8 mg, 0,4125 mmol), Diisopropylcarbodiimid (0,0673 ml, 0,4350mmol), Diisopropylethylamin (0,0757 ml, 0,4350 mmol) und eine 4: 1-Mischung von Dichlormethan und Dimethylformamid. Fügen Sie diese Cysteinkopplung Cocktail die Fritte Spritze und schütteln für 6 Stunden. Waschen unter Verwendung des zuvor beschriebenen Protokolls. </li><li> Bestätigen Koppeln mit der Ninhydrin-Test (-), gefolgt von der Entfernung der Fmoc-Komponente mit 20% Piperidin und Waschen. Den freien terminalen Amins mit dem Ninhydrintest (+). </li></ol></li><li> Die Spaltung von 1 von dem Harz. <ol><li> Machen Sie eine Lösung von TFA (9,45 ml), Wasser (0,25 ml), 1,2-Ethandithiol (0,25 ml) und Triisopropyl Silan (0,1 ml), ist es an der Spritze hinzufügen und leicht schütteln 4 Stunden. </li><li> Sammle den erhaltenen rotbraune Lösung in ein Eppendorf-Röhrchen und verdampfe das TFA langsam unter Verwendung eines Luftstroms. </li><li> Hinzufügen kaltem Diethylether (~ 15 ml) zu dem Eppendorf-Röhrchen zur Ausfällung 1, die leichtem Rühren bildet. Trennen Sie das Produkt durch Zentrifugation (1 g, 5 min). THenne Wiederholungszyklen Diethylether Waschungen (~ 60 ml Gesamtvolumen) und Zentrifuge 1 als rot / braunen Feststoff zu erhalten. </li></ol></li></ol> 2. Charakterisierung und Analyse von 1 <ol><li> Zu bestätigen, dass die Identität der Verbindung und in Figur 2 unter Verwendung von 1 H (16 Abtastungen) und 13 C-NMR (512 Abtastungen) in deuteriertem Methanol (300 ul) und ESI-MS-Analyse gezeigt Zusammensetzung übereinstimmt. Erwarten Sie die folgenden Ergebnisse: 1 H-NMR-Spektrum (CD 3 OD) δ / ppm: 1,407 bis 1,684 (m, 6H), 2,245 (t, 2H), 2,665-3,150 (m, 12H), 4,015 (t, 1H), 4.104 (d, 2H ), 4,274 (q, 1H), 4.426 (d, 2H), 4.479 (q, 1H), 4,595 (t, 1H) und 13 C-NMR-Spektrum (CD 3 OD) δ / ppm: 24,644 (CH 2), 25,472 (CH 2), 28,051 (CH 2), 28.300 (CH2), 35,474 (CH 2), 38.698 (CH2), 39,241 (CH 2), 39,717 (CH 2), 55,340 / 55,538 (Cp-Ring), 60,286 (CH), 61,964 (CH), 62,521 / 62,821 (Cp-Ring), 66,038 / 66,170 (Cp-Ring), 69,153 / 69,328 (Cp-Ring), 71,468 / 71,593 (Cp-Ring), 76,466 (CH), 171,770 (C = O), 175,361 (C = O). ESI-MS (m / z): Gefunden: 639,00 [1 + Na] +, Theoretische: 639,1 [1 + Na] + und HR-MS (m / z): Gefunden: 617,2049 [1 + H] +, Theoretisch: 617.1622 [1 + H] +. </li><li> Eine HPLC, Elementaranalyse, die Zusammensetzung der isolierten 1 bestätigen. Durchführung HPLC Chromatogramme unter Verwendung einer C8-Umkehrphasensäule mit 100% MeOH bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min. Hinweis: HPLC-Retentionszeiten waren: 3,198-4,674 min. </li></ol> 3. Immobilisierung von 1 auf einer Goldoberfläche <ol><li> Cut Polymer besicherten Gold-Folien in Quadrate von ~ 0,25 in 2. </li><li> Füllen eines 50 ml Becherglas mit DI-Wasser-Lösung von 1 (~ 1 mm). </li><li> Fügen Sie den Gold Folie, um das Becherglas geben und mit einem Uhrglas. Alleow die Glasobjektträger zu O / N bei RT inkubieren ohne Bewegung. </li><li> Entfernen Sie die Gold Folie aus der Lösung und lassen Sie es an der Luft trocknen. </li><li> Erhalten rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen mit einem Rasterelektronenmikroskop (oder Äquivalent) an immobilisiertes Beobachten 1. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die Synthese von asymmetrischen Ferrocenderivate ist eine Herausforderung in Lösung. Beispielsweise versucht 1 herzustellen, in Lösung in Folge geringen Ausbeuten an dem gewünschten Produkt (weniger als 20%). Ebenso Reaktionen unter Verwendung 1&#39;-amino-Ferrocencarbonsäure (sans Fmoc) und Harz gebundenen Biotins in unlöslichen Produkt konsistent mit dem polymerisierten Produkt durch Baristic et al. und minimale Produkt. 47 Dies wird weiter durch Ferrocen kompliziert und seine Derivate wobei Licht empfindlich sind und die Amino-Kongenere neigen, in Lösung zu dimerisieren. Diese Fragen stellen umfangreiche Reaktionen und Aufarbeitungen Herausforderung. Allerdings kann diese Reaktivität mit soliden ersten von Merrifield zur Synthese von Peptiden entwickelt Phasenverfahren umgangen werden. Die Synthese von Ferrocen-Peptid-Systemen hat die Aufmerksamkeit von mehreren Gruppen angesammelt und hat zu einer Bibliothek von asymmetrischen Peptid-Ferrocen Systeme geführt. 46,48-52 Die Arbeithierin beschriebenen Details der Synthese der ersten asymmetrischen Ferrocen bio-Konjugate, Biotin-Ferrocen-Cystein. Diese Verbindung dient als Modell, durch das andere kleine Molekül Rezeptoren könnte zum Nachweis von biologisch relevanten Molekülen angesehen werden. In dieser Arbeit wurde als Immobilisierung Leine an eine Goldoberfläche genutzt. Die erste Phase der Synthese war, wodurch ein immobilisiertes Biotin-Kern, auf einer Festkörper-Harz unter Verwendung eines Amin-basierten Linkers erhalten. Die N -Biotin- N &#39;-Fmoc-Ethylendiamin-Harz ist im Handel als Biotin NovaTag Harz gekauft werden und wurde als Grundlage für bio-Konjugat 1 verwendet. Die Fmoc-Aminosäure-Schutzgruppe wurde unter Verwendung einer 20% igen Lösung von Piperidin in Dimethylformamid und positiv (blau) Ninhydrintest bestätigt erfolgreiche Entschützung. Das freie Amin des Harz-gebundenen Biotins wurde dann verwendet, um Ferrocen Anker über eine Kupplung Cocktail Diisopropylethylamin besteht,Diisopropylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol-Hydrat. 40,46 eine Vielzahl von Ferrocen-Vorläufer sind für solche Zwecke erhältlich und umfassen Ferrocencarbonsäure und 1&#39;-Fmoc-amino-Ferrocencarbonsäure. Verwendung der früheren Systems Ausbeuten monosubstituierten bio-Konjugate, die nur einen der Cyclopentadienylringe mit einem Biotin Anhängsel modifiziert. Letztere Ferrocenderivat wird orthogonaler Substitution der Cyclopentadienylringe mit einer Carbonsäure und einer Fmoc-geschützten Aminogruppe besteht. Eine solche Substitution kann für ausgedehnte asymmetrische Modifikation des Ferrocen Kern Berücksichtigung separaten Modifikation der Cyclopentadienylringe an bio-Konjugate wie zum Beispiel 1 zu erzeugen. Die hellgelbe Kügelchen in einer leuchtend orangen Farbton bei erfolgreicher Kopplung des Ferrocen an das Biotin-Harzkern geändert, wie in Abbildung 2 dargestellt. In der nächsten Phase der Synthese einer Vielzahl von Linkern verbunden werden könntenan das freie Amin des harzgebundenen Ferrocen Kongener. Für die Zwecke dieses Systems wurde Cystein verwendet, da es ein Thiolat enthaltende Aminosäure. Der Thiolat-Komponente können zur Befestigung des bio-Konjugat an eine Goldoberfläche, wie nachfolgend erörtert. Modifikation mit Cystein durch Reaktion des Harzes gebunden System mit Fmoc-Cys (Mmt) -OH fort. Die Entfernung der Fmoc-Gruppe mit 20% Piperidin in Dimethylformamid ergibt die harzgebundenen Formen von 1. Das harzgebundene bio-Konjugat wurde von dem festen Träger durch die Abspaltung der bio-organometallische Systeme unter Verwendung einer Lösung von Trifluoressigsäure (TFA), Wasser und Triisopropyl silan entfernt. Die Verdampfung der sauren Lösung und Zugabe von kaltem Diethylether lieferte Bio-Konjugat 1 als rot-orangefarbenen Feststoff bestimmt, dass das TFA-Salz von 1 wie von der elementaren und NMR-Analyse bestätigt. Die Reinheit wurde durch HPLC-Analyse bestätigt. Zur Überprüfung des Konzepts für die ShowCystein-Komponente, die eine Befestigung Halteband für Bio-Konjugat 1, Ablagerung von 1 auf einer Goldoberfläche wurde untersucht. Die bekannte Au-S-Affinität ermöglicht einfache Immobilisierung von 1 auf einem Polymer besicherten Gold-Oberfläche. In diesem Experiment wurde die Gold-Oberfläche zu reinigen und leicht geschliffen wird. Der Objektträger wurde dann in eine ~ 1 mM wässrige Lösung von 1 getaucht, und man ließ auf O / N. Die Au-Oberfläche wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen und mit einem Kimwipe getrocknet. Die Goldträger wurden dann für die Modifikation mit SEM untersucht. Die in Figur 4 gezeigten Bilder sind repräsentativ für eine Monoschicht von 1 mit auf die Goldoberfläche gebildet. Die Fehler in der Oberfläche werden postuliert, um ein Ergebnis der &quot;Löcher&quot; in der Monoschicht von 1 und sind unter die weitere Erforschung von unserer Gruppe. Insgesamt sind die Synthesemethoden, um Ferrocen Biokonjugate herzustellen dassauf einer Goldoberfläche immobilisiert werden berichtet. Die Arbeit ist insofern neu, als die Synthese von asymmetrischen Ferrocenverbindungen wird durch eine Reihe von Nebenreaktionen führt zu niedrigen Ausbeuten und Reinheit gestellt. Wie Ferrocen-Biokonjugate ähnlich wie 1 finden Anwendung als mögliche Biosensoren, die Überwindung dieser Schwierigkeiten Kunst ist von größter Bedeutung. Mit Festphasenverfahren verwandt mit Festphasen-Peptidsynthese wurde ein gut charakterisiertes Biokonjugat 1, die Biotin-Ferrocen-Cystein enthält produziert. Weiterhin SEM wurde verwendet, um zu zeigen, dass dieses System in der Lage, an eine Goldoberfläche dank der Thiolat-Einheit der Cystein-Komponente zu haften. Insgesamt Die einfache Syntheseverfahren hierin sind jedoch problemlos für die Peptidsequenzen und bio-Konjugat Systeme für eine Reihe von Anwendungen modifiziert werden.

Biosensoren sind kleine Vorrichtungen, die biomolekulare Erkennungstechnologie zu verwenden, wie die Plattform für die selektive Analyse und sind für ihre Spezifität, Geschwindigkeit und kostengünstige verwendet. Elektrochemische Biosensoren zum Nachweis von Biomolekülen sind an der Spitze dieses Feldes aufgrund ihrer Einfachheit, Wirtschaftlichkeit und hohe Empfindlichkeit. 1,3 Die allgemeine Anatomie dieser Sensoren ist eine Elektrode mit einem Erkennungsmolekül ausgestattet spezifisch für die biologischen Marker von Interesse . Bindung des Biomarkers durch die Erkennungsmolekül führt zu einer lokalen Änderung des Potentials oder Stroms, der durch eine einfache Messung erfasst werden können. Um die Erkennungsgruppe stammen aus Enzymen reichen, 4-8 Antikörper, 9-12 ganze Zellen, 13-16 Rezeptoren 17-20 21-23 Peptide und DNA 24 und sind weitgehend auf größere, biologische Moleküle konzentriert. 25-28 Forschung Bemühungen in diesem Bereich haben sich hauptsächlich auf Immun whe konzentriertRe ein Immunglobulin mit einem Redox-aktiven Kern immobilisiert (zB Ferrocen) und verwendet, um einen Antikörper von Interesse zu detektieren. Diese Studien wurden von klinischen Anwendungen aufgrund der schlechten Präzision und Zeitaufwand von den Komplikationen, die sich aus der Nutzung von Antigen / Antikörper stammen ausgeschlossen. 1,3 Wachsende Aufmerksamkeit auf den Nachweis von kleinen Molekülen (weniger als 1 kg / mol) der biomedizinischen Schwerpunkt , Ernährung und Umwelt Interesse neben der nationalen Sicherheit. 29 Die bekanntesten Beispiele für Biosensoren sind Selbsttest Zuckermessgeräte, die Siebdruck Enzymelektroden zu einer Taschenformat amperometrischen Meter gekoppelt haben. Diese Systeme verwenden typischerweise einen coulometrischen Methode, wo die Gesamtmenge an Ladung von der Glucoseoxidationsreaktion erzeugt wird, über einen Zeitraum gemessen. Marktfähige Geräte sind tragbar, robust und in der Hand gehalten, um den Einsatz leicht für die breite Bevölkerung zu machen. Redox-Tags wie Ferrocen sind necessary, um die elektrochemische Detektion von Biomarkern oder kleinen Molekülen in Lösung zu bieten, da die meisten Biomarker sind nicht eigenelektrochemisch aktiv. 30-38 Ferrocen eine metallorganische Molekül, das einen Goldstandard für Elektrochemie, die es eine ausgezeichnete Wahl für die Integration in elektrochemischen Biosensoren macht. Ferrocen-basierte Redox-aktive Spezies wurden bereits große Aufmerksamkeit auf der Grundlage der Ferrocen Kern haben erhielt aufgrund ihrer geringen Größe, gute Stabilität, bequem synthetischen Zugang, einfache chemische Modifikation, relativen Lipophilie und Einfachheit der Redox-Tuning. 3,30-42 Kleine Moleküle intensiv als Detektoren von Metallionen und kleine Moleküle verwendet. 32-38,43 Systeme Targeting größeren Spezies wie Biomoleküle die Anbringung von großen Antikörper oder Immunoglobuline, Ferrocen-Derivate, die auf einer elektrochemischen Oberflächen eingebettet wurden verwendet. 1,3,39 44 In jedem Fall ist das Potential und Strom intensiviertty der Fe-III / Fe II Redoxpaar wurde auf molekulare Kopplung verändert wird, wodurch eine neue spektroskopische Griff, das die Anwesenheit des Analyten Molekül. Diese Änderung ergibt sich aus der umfangreichen Überlappung zwischen dem pi-Systems der Cyclopentadienylringe und den Eisen d-Orbitale auftritt. Wenn das pi-Systems geändert wird, dh, derivatisiert oder umgesetzt wird, dann wird die Bahn-Wechselwirkung wird wiederum Veränderung. Dies wird die Fe Kern beeinflussen und kann als eine Verschiebung des Potentials des Fe-III / Fe II Paar beobachten. 40,45,46 Diese Eigenschaften machen ein solches System attraktiv zur Verwendung als ein Quantifizierungsmittel in einer elektrochemischen Immunoassay oder Biosensor. Um spezifisch für Biosensor Kapazitäten Ferrocen Systeme erzeugen ist es optimal, ein Cp-Ring mit dem Bio-Rezeptor spezifisch für ein Zielmolekül zu modifizieren und nutzen die anderen Cp Ring als Molekular Haltegurt an die elektrochemische Auslese oder elektrode (Abbildung 1). Synthese dieser asymmetrischen Ferrocenderivate wird durch Nebenreaktionen und die Bildung von auf intermolekulare Vernetzung gebildet dimere und polymere Spezies in Frage. 47 ist jedoch Kopplungschemie Herstellung einer Amidbindung der direkteste Weg zu einfachen Derivaten des Ferrocens mit biologischen Komponenten, wie beispiels bereitzustellen Peptide und deren Metaboliten. Daher können Festphasenverfahren zuerst in den 1950er Jahren von Merrifield für die Peptidsynthese entwickelt, um metallorganische Verbindungen Ferrocen verwendet werden. Durch die Verwendung des orthogonal substituiert 1&#39;-Fmoc-amino-ferrocen-1-carbonsäure-Molekül, ein System, das ein Ferrocen-Rezeptoreinheit (Biotin), elektroAuslese (Ferrocen) und Immobilisieren-Linker-Komponente (Cystein) enthalten kann, hat gebaut und hier detailliert beschrieben. Die Synthese dieser Bio-Konjugat wird ebenso diskutiert wie Beweise für die Immobilisierung auf einer Goldoberfläche. Diese Arbeit Vertrets der ersten Präsentation eines Systems von Biotin, Ferrocen und einer Aminosäure zur Immobilisierung auf einer Goldoberfläche besteht.

<table><tbody><tr><td>Biotin Novatag Resin</td><td>NovaBiochem</td><td>8550510001</td><td></td></tr><tr><td>TORVIQ 10 ml Luer Lock Fritted Syringe</td><td>Fisher</td><td>NC9299151</td><td></td></tr><tr><td>piperidine</td><td>Acros</td><td>P/3520/PB05</td><td></td></tr><tr><td>ninhydrin test</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017-1ea</td><td></td></tr><tr><td>1&amp;rsquo;-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid</td><td>Omm Scientific</td><td>Special Order</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Diisopropylcarbodiimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D125407-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Novabiochem</td><td>8520080025</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5408</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ethanedithiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>triisopropyl silane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes (20 ml)</td><td>any source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>any source</td><td></td><td>dry with molecular sieves prior to use &amp;amp; store in 100 ml media bottle for easy usage</td></tr><tr><td>dichloromethane</td><td>any source</td><td></td><td>dry with molecular sieves prior to use &amp;amp; store in 100 ml media bottle for easy usage</td></tr><tr><td>dimethylformamide</td><td>any source</td><td></td><td>dry with molecular sieves prior to use &amp;amp; store in 100 ml media bottle for easy usage</td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>any source</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

synthetic methodology for asymmetric ferrocene derived bio-conjugate systems via solid phase resin-based methodology

Früherkennung ist ein Schlüssel zur erfolgreichen Behandlung der meisten Krankheiten, und ist vor allem dann wichtig für die Diagnose und Behandlung von vielen Arten von Krebs. Die am häufigsten verwendeten Techniken sind bildgebende Verfahren wie Kernspintomographie (MRT), Positronen-Emissions-Topographie (PET) und Computertomographie (CT) und sind optimal für das Verständnis der physikalischen Struktur der Krankheit, kann aber nur einmal alle vier durchgeführt werden 6 Wochen durch die Verwendung von bildgebenden Mittel und die Gesamtkosten. Vor diesem Hintergrund ist die Entwicklung der &quot;Point of Care&quot; Techniken wie Biosensoren, die das Stadium der Erkrankung und / oder Wirksamkeit der Behandlung in der Praxis des Arztes zu bewerten und tun dies in einer angemessenen Zeitspanne, würde Behandlungsprotokolle zu revolutionieren. 1 Wie ein Mittel, um zu erforschen Ferrocen Biosensoren zum Nachweis von biologisch relevanten Molekülen 2 wurden Methoden entwickelt, um Ferrocen-Biotin hierin beschriebenen Bio-Konjugaten. Dieser Bericht wird auf einer Biotin-Ferrocen-Cystein-System, das auf einer Goldoberfläche immobilisiert werden können, konzentrieren.

Das Harz-gebundenen Form von 1 ist in 2 gezeigt. Die kovalente Bindung des Ferrocen-Komponente führt zu einem orangen Farbton mit den Harzperlen, die persistent mit kontinuierlichen Waschen und indikativ für einen immobilisierten eisenhaltigen Komplex ist, um die Eisenaufnahme im Gegensatz durch die PEG-Komponente des Harzkügelchens. Die harzfreien Form 1 ist in der Farbe der Harzkügelchen identisch. Nach der Entfernung der Verbindung aus den Harzperlen, die Reinheit und die Ausbeute (68%) aus den Verfahren resultierenden weit überlegen typischen Lösungsmethodik. Die Elementaranalyse des Produkts zeigte, daß 1 wurde als das TFA-Salz isoliert: berechnet (gefunden) für C 26 H 36 FeN 6 O 4 S 2 4TFA: C, 38,07 (38,90); H, 3,76 (4,20); N, 7,83 (7,70). Die resultierende Ausbeute (105,1 mg, 68%) aus einer typischen Reaktion wird auf die Ergebnisse der Elementaranalyse basiert. NMR-Analyse in deuteriertem Methanol provided 1 H-NMR-Spektrum (CD 3 OD) δ / ppm: 1,407 bis 1,684 (m, 6H), 2,245 (t, 2H), 2,665-3,150 (m, 12H), 4,015 (t, 1H), 4.104 (d, 2H), 4,274 (q, 1H), 4.426 (d, 2H), 4.479 (q, 1H), 4,595 (t, 1H) und 13 C-NMR-Spektrum (CD 3 OD) δ / ppm: 24,644 (CH 2), 25,472 (CH 2), 28,051 (CH 2), 28.300 (CH2), 35,474 (CH 2), 38.698 (CH2), 39,241 (CH 2), 39,717 (CH 2), 55,340 / 55,538 (Cp-Ring) , 60,286 (CH), 61,964 (CH), 62,521 / 62,821 (Cp-Ring), 66,038 / 66,170 (Cp-Ring), 69,153 / 69,328 (Cp-Ring), 71,468 / 71,593 (Cp-Ring), 76,466 (CH ), 171,770 (C = O), 175,361 (C = O). HPLC-Retentionszeiten waren: 3,198-4,674 min. Die bei der HPLC-Analyse mehrere Peaks beobachtet wurde bestätigt, daß TFA-Salze von 1, wie oben mit Hilfe der Elementaranalyse beschrieben. Massenspektrometrie der Struktur korreliert in Figur 2 gezeigt: ESI-MS (m / z): Gefunden: 639,00 [1 + Na] +,Theoretisch: 639,1 [1 + Na] + und HR-MS (m / z): gefunden: 617,2049 [1 + H] +, Theoretisch: 617,1622 [1 + H] +. Elektronischen Absorptionsspektren wurden in Wasser erhalten und zeigte λ max (ε, M -1 cm -1) 268 (4,779.8), 434 (324,26). Die verwendet werden, um einen kleinen Gold Folie in einer Lösung von 1-Biokonjugat inkubieren Verfahren sind in der schematischen Darstellung in Figur 3 dargestellt. Eine dünne Schicht aus Gold Rückseite mit Polymermaterial wurde zu einer Lösung von 1 zugegeben und inkubieren gelassen O / N. Die Goldobjektträger wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen und trocknen gelassen. Gleichzeitig eine Goldträger wurde in entionisiertem Wasser co-inkubiert und auf die gleiche Weise gewaschen. SEM-Bilder der beiden Proben, die in 4 gezeigt ist, zeigte, dass die Oberfläche des mit 1 Goldschieber coinkubiert wurde modifiziert. Dies zeigt an, dass dieThiolat Wechselwirkungen von 1 liefern einen Anker zur Befestigung an der Goldoberfläche. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52399/52399fig1.jpg" /> Abbildung 1. Grundlagen eines Biosensors. Ein spezifisches Beispiel für einen elektrochemischen Biosensor, ein Target in Lösung direkt nachzuweisen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52399/52399fig2.jpg" /> Abbildung 2. Synthetische Methoden 1. Die verwendeten, um einen kleinen Gold Folie in einer Lösung von 1-Biokonjugat inkubieren Verfahren verwendet werden, sind in der schematischen Darstellung in Figur 3 dargestellt. Eine dünne Schicht aus Gold Rückseite mit Polymermaterial wurde zu einer Lösung von 1 und inkubieren O / N. Die Goldobjektträger wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen und trocknen gelassen. Gleichzeitig eine Goldträger wurde in entionisiertem Wasser co-inkubiert und auf die gleiche Weise gewaschen. SEM-Bilder der beiden ProbenIn 4 gezeigt ist, zeigte, dass die Oberfläche des mit 1 Goldschieber coinkubiert wurde modifiziert. Dies zeigt, daß die Thiolat-Wechselwirkungen von 1 liefern einen Anker zur Befestigung an der Goldoberfläche. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52399/52399fig3.jpg" /> Abbildung 3 Schematische Zeichnung, die die Immobilisierung von 1 auf einen Goldträger. Das Verfahren beinhaltet das Auflösen des Biokonjugats in Wasser und Zugabe der Gold Folie. Inkubation O / N wird durch Waschen des Schiebers folgt. Analyse für erfolgreiche Immobilisierung wird unter Verwendung von in Figur 4 gezeigten Rasterelektronenmikroskopie durchgeführt. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52399/52399fig4.jpg" /> Abbildung 4. SEM-Bilder von Gold auf ein Kunststoffpolymerfilm beschichtet ist. (A) Inkubation sans 1 und (B) following Inkubation mit 1 in Wasser O / N und mit Wasser gespült.

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Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

Synthesemethoden für Asymmetric Ferrocen abgeleitete Bio-Konjugat-Systemen über Festphasen-Resin-basierte Methodik

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Serie: Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Synthese von Protein Biokonjugate<em&gt; über</em&gt; Cystein-maleimid Chemie

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Forschung

Chemie

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as Ru(II), Pt(II), and Rh(III). The compound, named as a water-soluble metal-organic complex array (WSMOCA), is obtained through 1) the conventional solution-chemistry-based preparation of the corresponding metal complex monomers having a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-protected amino acid moiety and 2) their sequential coupling together with other water-soluble organic building units on the surface-functionalized polymeric resin by following the procedures originally developed for the solid-phase synthesis of polypeptides, with proper modifications. Traces of reactions determined by mass spectrometric analysis at the representative coupling steps in stage 2 confirm the selective construction of a predetermined sequence of metal centers along with the peptide backbone. The WSMOCA cleaved from the resin at the end of stage 2 has a certain level of solubility in aqueous media dependent on the pH value and/or salt content, which is useful for the purification of the compound.

A potential general method for the synthesis of water-soluble multimetallic peptidic arrays containing a predetermined sequence of metal centers is presented.

Synthese eines wasserlöslichen Metall-organische Komplexe Array

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation. In addition, this protocol describes the preparation of vinyl-sulfide-tethered peptides using in-solution intramolecular thiol-yne hydrothiolation between amino acids that possess alkene/alkyne side chains and cysteine residues at i, i+4 positions. Linear peptides were synthesized using a standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation is carried out using either an intramolecular thio-ene reaction or an intermolecular thio-ene reaction, depending on the peptide length. In this research, an intramolecular thio-ene reaction is carried out in the case of shorter peptides using on-resin deprotection of the trityl groups of cysteine residues following the complete synthesis of the linear peptide. The resin is then set to UV irradiation using photoinitiator 4-methoxyacetophenone (MAP) and 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). The intermolecular thiol-ene reaction is carried out by dissolving Fmoc-Cys-OH in an N,N-dimethylformamide (DMF) solvent. This is then reacted with the peptide using the alkene-bearing residue on resin. After that, the macrolactamization is carried out using benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), and 4-Methylmorpholine (NMM) as activation reagents on the resin. Following the macrolactamization, the peptide synthesis is continued using standard SPPS. In the case of the thio-yne hydrothiolation, the linear peptide is cleaved from the resin, dried, and subsequently dissolved in degassed DMF. This is then irradiated using UV light with photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Following the reaction, DMF is evaporated and the crude residue is precipitated and purified using high-performance liquid chromatography (HPLC). These methods could function to simplify the generation of thioether-tethered cyclic peptides due to the use of the thio-ene/yne click chemistry that possesses superior functional group tolerance and good yield. The introduction of thioether bonds into peptides takes advantage of the nucleophilic nature of cysteine residues and is redox-inert relative to disulfide bonds.

We present a protocol for the construction of thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides using photo-induced thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

Bau von Thioether/Vinyl-sulfid-angebunden spiralförmige Peptide über Foto-induzierte Thiol-ene/Yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Solid-phase Synthesis of [4.4] Spirocyclic Oximes

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of solid-phase synthesis, regenerating Michael (REM) linker strategies, and 1,3-dipolar cycloaddition, a library of structurally similar heterocycles, both with and without a spirocyclic center, can be constructed. The main advantages of the solid-support synthesis are as follows: first, each reaction step can be driven to completion using a large excess of reagents resulting in high yields; next, the use of commercially available starting materials and reagents keep the costs low; finally, the reaction steps are easy to purify via simple filtration. The REM linker strategy is attractive because of its recyclability and traceless nature. Once a reaction scheme is completed, the linker can be reused multiple times. In a typical solid-phase synthesis, the product contains either a part of or the whole linker, which can prove undesirable. The REM linker is &#34;traceless&#34; and the point of attachment between the product and the polymer is indistinguishable. The high diastereoselectivity of the intramolecular 1,3-dipolar cycloaddition is well documented. Limited by the insolubility of the solid support, the reaction progression can only be monitored by a change in the functional groups (if any) via infrared (IR) spectroscopy. Thus, the structural identification of intermediates cannot be characterized by conventional nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Other limitations to this method stem from the compatibilities of the polymer/linker to the desired chemical reaction scheme. Herein we report a protocol that allows for the convenient production of spirocyclic heterocycles that, with simple modifications, can be automated with high-throughput techniques.

Here we present a protocol to demonstrate an efficient method for the synthesis of spirocyclic heterocycles. The five-step process utilizes solid-phase synthesis and regenerating Michael linker strategies. Generally difficult to synthesize, we present a customizable method for the synthesis of spirocyclic molecules otherwise inaccessible to other modern approaches.

Festphasen-Synthese von [4,4] Spirocyclic Oximes

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Synthese und Biokonjugaten der Thiol-reaktive Reagenzien für die Erstellung der Website selektiv geändert Immunokonjugate

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Preparation of Site-Specific Cytotoxic Protein Conjugates via Maleimide-thiol Chemistry and Sortase A-Mediated Ligation

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as growth factor receptors on their surface. This feature enables development of highly selective therapeutics, the protein bioconjugates, composed of targeting proteins (antibodies or receptor ligands) connected to highly cytotoxic drugs by a specific linker. Due to very high affinity and selectivity of targeting proteins the bioconjugates recognize marker proteins on the cancer cells surface and utilize receptor-mediated endocytosis to reach the cell interior. Intracellular vesicular transport system ultimately delivers the bioconjugates to the lysosomes, where proteolysis separates free cytotoxic drugs from the proteinaceous core of the bioconjugates, triggering drug-dependent cancer cell death. Currently, there are several protein bioconjugates approved for cancer treatment and large number is under development or clinical trials.
One of the main challenges in the generation of the bioconjugates is a site-specific attachment of the cytotoxic drug to the targeting protein. Recent years have brought a tremendous progress in the development of chemical and enzymatic strategies for protein modification with cytotoxic drugs. Here we present the detailed protocols for the site-specific incorporation of cytotoxic warheads into targeting proteins using a chemical method employing maleimide-thiol chemistry and an enzymatic approach that relies on sortase A-mediated ligation. We use engineered variant of fibroblast growth factor 2 and fragment crystallizable region of human immunoglobulin G as an exemplary targeting proteins and monomethyl auristatin E and methotrexate as model cytotoxic drugs. All the described strategies allow for highly efficient generation of biologically active cytotoxic conjugates of defined molecular architecture with potential for selective treatment of diverse cancers.

Here we provide detailed protocols for a site-specific labeling of proteins with cytotoxic drugs using maleimide-thiol reaction and sortase A-mediated ligation.

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as ...

Biochemie

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper tumor cells, leading to tumor recurrence. To conquer the limited penetration of biological barriers, cell-penetrating peptides (CPPs) have been discovered with excellent membrane translocation ability and have emerged as useful molecular transporters for delivering various cargoes into cells. However, conventional linear CPPs generally show compromised proteolytic stability, which limits their permeability across biological barriers. Thus, the development of novel molecular transporters that can penetrate biological barriers and exhibit enhanced proteolytic stability is highly desired to promote drug delivery efficiency in biomedical applications. We have previously synthesized a panel of short cyclic CPPs with aromatic crosslinks, which exhibited superior permeability in cancer cells and tissues compared to their linear counterparts. Here, a concise protocol is described for the synthesis of the fluorescently labeled cyclic polyarginine R8 peptide and its linear counterpart, as well as key steps for investigating their cell permeability.

This protocol describes the synthesis of cyclic cell-penetrating peptides with aromatic cross-links and the evaluation of their permeability across biological barriers.

Konstruktion zyklischer zellpenetrierender Peptide zur verbesserten Durchdringung biologischer Barrieren

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as a consequence, they are now used clinically. It is, therefore, critical to seek effective strategies for synthesizing cyclic peptides to promote their application in the field of drug discovery. This paper reports a detailed protocol for the efficient synthesis of cyclic peptides using on-resin or intramolecular (intermolecular) bisalkylation. Using this protocol, linear peptides were synthesized by taking advantage of solid-phase peptide synthesis with cysteine (Cys) and methionine (Met) coupled simultaneously on the resin. Further, cyclic peptides were synthesized via bisalkylation between Met and Cys using a tunable tether and an on-tether sulfonium center. The whole synthetic route can be divided into three major processes: the deprotection of Cys on the resin, the coupling of the linker, and the cyclization between Cys and Met in a trifluoroacetic acid (TFA) cleavage solution. Furthermore, inspired by the reactivity of the sulfonium center, a propargyl group was attached to the Met to trigger thiol-yne addition and form a cyclic peptide. After that, the crude peptides were dried and dissolved in acetonitrile, separated, and then purified by high-performance liquid chromatography (HPLC). The molecular weight of the cyclic peptide was confirmed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), and the stability of the cyclic peptide combination with the reductant was further confirmed using HPLC. In addition, the chemical shift in the cyclic peptide was analyzed by 1H nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectra. Overall, this protocol aimed to establish an effective strategy for synthesizing cyclic peptides.

This protocol presents the synthesis of cyclic peptides via bisalkylation between cysteine and methionine and the facile thiol-yne reaction triggered by the propargyl sulfonium center.

Konstruktion zyklischer Peptide mit einem On-Tether-Sulfoniumzentrum

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

Festphasensynthese eines funktionalisierten Bis-Peptids unter Verwendung von &quot;Safety-Catch&quot;-Methodik

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Biologie

Solid Phase Synthesis

Source: Vy M. Dong and Diane Le, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
Merrifield&#39;s solid-phase synthesis is a Nobel Prize winning invention where a reactant molecule is bound on a solid support and undergoes successive chemical reactions to form a desired compound. When the molecules are bound to a solid support, excess reagents and byproducts can be removed by washing away the impurities, while the target compound remains bound to the resin. Specifically, we will showcase an example of solid-phase peptide synthesis (SPPS) to demonstrate this concept.

Solid Phase Synthesis: Principles, Peptide Synthesis

Festphasen-Synthese

Source: Vy M. Dong and Diane Le, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
Merrifield&#39;s solid-phase synthesis is a Nobel Prize ...

Synthesemethoden für Asymmetric Ferrocen abgeleitete Bio-Konjugat-Systemen über Festphasen-Resin-basierte Methodik

Zusammenfassung

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Synthese von Protein Biokonjugate