Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Boh&#243;rquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.

Alle Tierpflege und Experimente wurden in Übereinstimmung mit einem Protokoll, das von der Duke University Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt wurde. Cocem3D stammten aus einer Kombination der zuvor veröffentlichten Protokollen 10,11 und wurde hier angewendet, um eine bestimmte enteroendokrine Zelle unter Verwendung eines Reporter PyyGFP Maus 12 zu studieren. Dieses Verfahren kann leicht auf andere Zellen von Interesse unter Verwendung von kommerziell erhältlichen transgenen Mäuse Reportergen angewendet werden. Correlative Konfokalmikroskopie serielle Block-face Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) und Datendarstellung in 3D: Das Verfahren wird in drei Abschnitten beschrieben. Korrelat konfokale Mikroskopie Das Ziel dieses Abschnitts ist es, eine Gewebesegments aus dem distalen Kolon von Dimensionen, die korrelative konfokale Bildgebung SBEM ermöglichen ernten. Das Protokoll ist wie folgt: 1. Ernten der Tissue <ol><li> Bereiten10 ml von 50 ug / ml Heparinlösung in PBS. </li><li> Vorbereitung Xylazin / Ketamin Narkose Lager durch Mischen von 10 ml Ketamin (100 mg / ml) und 1 ml Xylazin (20 mg / ml). <ol><li> Verdünnen Xylazin / Ketamin Lager 1: 4 in 0,1 M PBS. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine 100 ml Fixierlösung mit 4% Paraformaldehyd und 0,1% Glutaraldehyd in PBS. </li><li> Betäuben eine PyyGFP Maus, 6 bis 10 Wochen alt, mit einer letalen Dosis von Xylazin / Ketamin-Narkose. Spritzen Sie die Narkose intraperitoneal mit 0,15 ml pro 20 g Mausgewicht. </li><li> Bestätigen Sie die richtige Maus Betäubung durch Einklemmen des Schwanzes oder Zehen, und verwenden Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit zu verhindern. </li><li> Verwenden Sie eine variable Strömungs peristaltische Pumpe zu Fixiermittel intrakardial 10 durchströmen. Verwendung chirurgische Scheren (13 cm Länge) geschnitten öffnen Sie die Bauchhöhle, den Darm, Herz und Lunge aus. Halten Sie Herz mit Schmal Muster gebogenen Pinzette (12 cm Länge), und setzen Schmetterlingsnadel (19 G) aus Schlauchpumpe into linken Ventrikels. Unmittelbar, schneiden rechten Vorhof mit Feder geraden Schere (Länge 4 mm). Perfusion mit einer Geschwindigkeit von 2 ml / min zunächst mit Heparin-Lösung für 1 min, und dann mit eiskaltem Fixierungslösung für 15 Minuten, bis der Maus den Schwanz ist völlig starr. Anmerkung: Es ist sehr wichtig, um bei einer langsamen Rate zum Bersten der kleinen Gefäße in der Darmschleimhaut verhindert perfundieren. Platzen der Schiffe wird Ultrastruktur des Gewebes beeinträchtigen. Wenn Perfusion angemessen ist, die Leber sollte blass in der Farbe innerhalb 3-5 min drehen. </li><li> Mit Hilfe einer kleinen Schere öffnen Sie die Bauchhöhle und der Verbrauch den gesamten Dickdarm von der Kreuzung mit der Blinddarm zum distalen Rektum. Legen Sie das Gewebe in eiskaltem PBS. Während in PBS eingetaucht, aufgeschnitten mit kleinen Feder Schere den Doppelpunkt entlang der Mesenterium. </li></ol> 2. Präparieren und Befestigungsgewebesegmente <ol><li> Mit einem Skalpell geschnitten etwa 6 kleine Gewebesegmente (2 mm 2) aus dem distalen Kolon. Tun Sie dies auf einem Blatt of Dentalwachs und in einigen Tropfen PBS eingetaucht. </li><li> Post-fix die Gewebesegmente in Fixierungslösung für 3 h bei 4 ° C. </li></ol> 3. Micro-Sezieren Gewebeblöcke <ol><li> Bereiten Sie 5% niedrig schmelzenden Agarose in PBS und halten Sie sie in einem Wasserbad bei 45 ° C. </li><li> Die Gewebesegmente einbetten in 5% niedrig schmelzende Agarose mit einem kleinen Kunststoffbehälter, wie die Standard-Größe Tissue-Tek Cryomold. </li><li> Montieren Sie die eingebetteten Abschnitte auf einer vibrierenden Klinge Mikrotom und füllen Sie die Pufferwanne mit eiskaltem PBS. </li><li> Cut 300 um Gewebestreifen bei 0,8 Amplitude und 0,04 mm / s Geschwindigkeit. Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt werden die Gewebestreifen aus der Agarose verdrängt werden. </li><li> Re-Einbettung 300 um Gewebestreifen in Agarose und montieren sie am Mikrotom senkrecht zur Vibratom Klinge. </li><li> Mit einem Vibratom geschnitten Gewebestreifen in einer Dicke von 50 um. Hinweis: Die endgültige Gewebeblöcke sollten etwa 300 &amp; mgr; m breit x 50 &amp; mgr; m dick sein. Diese dbmessungen von Pilot konfokalen Experimente, die zeigten, dass die Dicke der enteroendokrinen Zelle zwischen 15-20 um und die neuropod der Länge von 30 bis 70 nm optimiert. Daher könnte eine gesamte Zelle in einem Gewebeblock 300 um Breite und 50 um Dicke enthalten sein, wenn die Ausrichtung der Zelle parallel zu der Fläche der Gewebeblock ist. Variieren diese Dimensionen je nach Gewebe und Zelltyp von Interesse. </li><li> Die Gewebeblöcke in PBS bei 4 ° C. </li></ol> 4. Die konfokale Imaging <ol><li> Bereiten Sie eine Kernfärbung DAPI-Lösung durch Verdünnung in PBS bei 1: 4.000. </li><li> Inkubieren Gewebeblöcke in DAPI Kernfärbung für 5 min. Anmerkung: DAPI-Färbung erleichtert Scheidungs ​​einzelnen Zellen durch ihre Kerne, die hilfreich zum Korrelieren der konfokale SBEM Bildern ist. </li><li> Berg Gewebeblöcke auf geladene Objektträger aus Glas, ein paar Tropfen von PBS, und decken Sie sie mit einem Deckglas. </li><li> Mit einem konfokalen Mikroskop identifizieren Blocks mit intakter Villi und PyyGFP Zellen von Interesse und bebildert sie z-Stacks optische Schnitte zu erhalten. <ol><li> Verwenden Sie eine 20-fach / 0,8 Zeiss Plan Apochromat Ziel, z-Stacks von 1 um optische Schnitte zu erhalten. </li><li> Zur Z-Stapel, verwenden die Kanäle für 405 nm (DAPI), um die Beziehung zu anderen Zellen zu bestimmen, auf 488 nm endogenen GFP die Zelle von Interesse zu lokalisieren, und die Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) an Stelle der Zelle in Bezug auf die Bestimmung Lumen. </li><li> Verwenden Sie Bildauflösung von 1024 Pixel oder höher. </li></ol></li></ol> 5. Embedding Blocks in Agarose <ol><li> Herstellung von 10 ml Fixiermittel, enthaltend 4% Paraformaldehyd und 2,5% Glutaraldehyd in PBS. </li><li> Die Gewebeblöcke vom Glas-Objektträger zu entfernen durch vorsichtige Zugabe von PBS in den Kanten des Deckglases an das Deckglas ohne Beschädigung der Gewebeblock aus dem Glasträger zu gleiten. Verwenden Sie dann eine schöne Kunstmalerpinsel, um das Gewebe Block von der Folie, um eine 1 übertragen0,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, enthaltend 4% Paraformaldehyd und 2,5% Glutaraldehyd Fixativ. </li><li> Post-fix Gewebeblöcke O / N bei 4 ° C. </li><li> Übertragen Gewebeblöcke auf PBS. Dann einbetten Blöcke flach in 5% niedrig schmelzende Agarose durch sandwich sie zwischen zwei Glasobjektträger. Hinweis: Einbetten der Blöcke in einer dünnen Schicht von Agarose erleichtert posterior Manipulation während der Färbung. </li><li> Schneiden Sie die Agarose in einem Quadrat und eine Kerbe auf der oberen Seite. Anmerkung: Dieser Schritt ist notwendig, um die Ausrichtung in den folgenden Schritten erhalten. </li><li> Speicher Blöcke in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS bei 4 ° C bis zur Weiterverarbeitung. </li></ol> Serienblock Gesicht Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) In diesem Abschnitt wird die Gewebeblock hergestellt und mit SBEM abgebildet bei niedriger Vergrößerung. Das Übersichtsbild der Blockfläche wird dann mit den konfokalen Daten korreliert, um die Region, die die Zelle von Interesse zu identifizieren. Sobald die Regionidentifiziert ist, wird das Gewebe bei einer Auflösung von 7 nm / Pixel und Scheiben von 70 nm abgebildet. Dies war ausreichend, um zu beheben und zu unterscheiden groß dichten Kern sekretorischen Vesikeln aus anderen Organellen. In enteroendokrinen Zellen variiert diese Art von Vesikel zwischen 100 und 150 nm im Durchmesser, 13. Das Protokoll ist wie folgt: 6. Färbung Gewebeschnitten <ol><li> Entfernen Gewebe aus PBS und spülen dreimal jeweils 5 Minuten in 0,1 M Cacodylatpuffer. </li><li> Fleckenblöcke für 1 h in 0,1% Gerbsäure in 0,1 M Cacodylat-Puffer gelöst, um den Kontrast von Zellmembranen 14 verbessern. </li><li> Führen Sie nachfolgende Färbung und Austrocknung von Gewebe nach dem veröffentlichten Protokoll 11. Folgende Deerinck et al. Protokoll, bereiten diese Lösungen: 1) 1% (w / v) thiocarbonhydrazide (THC); 2) führen Aspartat-Lösung; 3) 1% Uranylacetat und 4) osmium tetraoxyde / Kaliumferrocyanid (OsO 4 / K Ferrocyanide). Mischen Sie 4% OsO 4 und 2xK Ferrocyanide stock [0,3 g K Ferrocyanide und 0,86 g Na Cacodylat in 10 ml H 2 O] im Verhältnis 1: 1 OsO 4 / K Ferrocyanide zu machen. Hinweis: Nachdem die in Agarose eingebetteten Gewebe erleichtert die Handhabung während der Färbung. Agarose für nachfolgende Harzinfiltration vorsichtig entfernen. </li><li> Spülen Proben dreimal jeweils 5 Minuten in 0,1 M Cacodylatpuffer und dann Fleck mit OsO4 / K-Ferrocyanid Lösung für 2 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Spülen in Reinstwasser dreimal mit je 5 min, und Fleck mit TCH für 30 min bei 60 ° C. </li><li> Spülen in Reinstwasser dreimal, jeweils 5 min und Fleck mit 2% OsO 4 (kein Ferrocyanid K) für 60 min bei RT. Wieder spülen in ultrareinem Wasser dreimal mit je 5 min. </li><li> Fleck mit 1% Uranylacetat O / N bei 4 ° C. Spülen in Reinstwasser dreimal mit je 5 min. </li><li> Fleck mit Blei Aspartat für 30 min bei 60 ° C. Spülen in Reinstwasser dreimal mit je 5 min. </li><li> Dehydratisieren Gewebe durch Spülen in solutions mit steigenden Konzentrationen von Ethanol. Spülen 2 mal jeweils 5 Minuten mit 50%, 75%, 85%, 95% und 100% absoluten Ethanol. Am Ende gründlich Abschnitte mit Propylenoxid zweimal, jeweils 10 Minuten. </li></ol> 7. Als Spion and Embedding Gewebeschnitte in Resin <ol><li> Infiltrieren, die Blöcke mit Harz unter Verwendung der kommerziell avaialble kit. Betten Sie Gewebe in Harz mit einem EPON Einbettung kit. Vorbereitung einer Harzmischung aus 48% Epoxid, 20% ml DDSA, 30% NMA ml und 2% DMP30. Agitieren Harzgemisch 5 min kräftig und legen Sie dann mix im Vakuum für 30 Minuten, damit Luftblasen an die Oberfläche zu kommen. </li><li> Mischen Sie Harz mit Propylenoxid bei 1: 1-Verhältnis und kräftig schütteln. Entfernen Sie die endgültige Austrocknung Spülen von Geweben und fügen Harz vermischt mit Propylenoxid. Platz Fläschchen mit Proben in einem Rotator O / N und lassen Fläschchen nicht begrenzten. Am nächsten Tag, fügen Sie frisch zubereitete EPON-Harz und Mischen für 90 min in Rotator. </li><li> Betten Sie Blöcke in Harz so flach wie möglich durch Einfügen sie inzwischen Glasobjektträgern, die mit flüssigem Trennmittel ausgehärtet sind, um sie von aneinander kleben 15 verhindern. </li><li> Sobald die Blöcke Flach eingebettet, heilen die Bausteine ​​für eine zusätzlich 48 Stunden bei 60 ° C. </li><li> Ziehen Sie gleitet auseinander, um die Blöcke zu lösen. </li></ol> 8. Montage und Trimmen des Tissue-Block für Imaging <ol><li> Unter einem Binokular, passen Sie die Ausrichtung der Gewebeblöcke in Harz mit dem der konfokalen mikroskopischen Aufnahmen eingebettet, um zu erleichtern die Identifizierung der Bereiche, die Zellen von Interesse enthält vor dem Trimmen den Block. </li><li> Schneiden Sie das Harz eingebettet Block manuell bis zu einer ~ 500 x 500 &amp; mgr; m-Block-face. </li><li> Montieren Sie den Block flach auf einem Stift, die leitfähige Epoxidharz und trocken für 30 Minuten. Dann lag der Block flach auf einer Oberfläche und trocken O / N bei 60 ° C. </li><li> Mantel der Block mit kolloidalem Silber Flüssigkeit. Pflegen Sie die Gewebeschnitte flach Schneiden des Blocks in einem rechten Winkel zu gewährleisten, um die Zusammenarbeit zu erleichtern,rrelating die Serienblock-face und konfokale Mikroaufnahmen. </li></ol> 9. SBEM <ol><li> Bild der Block mit einem Rasterelektronenmikroskop ausgestattet mit einem SBEM System (z .B., 3View). </li><li> Set Ausgangsdicke Schnitt bei ~ 2 &amp; mgr; m-Schritten und schneiden, bis das Gesicht des Gewebes ergibt sich aus dem Block. </li><li> Erwerben Sie eine Surver Bild des gesamten Block Gesicht. </li><li> Verwendung Fiji Software, Messungen sowohl die Serienblock-face und konfokale Mikroaufnahmen, einen gemeinsamen Nenner und machen Musterkettenschär während Fixierung und Färbung 16 zu erzeugen. </li><li> Suchen Sie den Bereich von Interesse auf der Blockfläche durch Multiplikation der Nenner auf die Koordinaten in den konfokalen Bildern. Verwenden auch andere strukturelle Merkmale, wie die Position der Mikrovilli, Becherzellen oder der Lamina propria als Referenz. </li><li> Bild Region von Interesse in eine 2,25 kV und 7 nm / Pixel (oder 15,147X Vergrößerung) in Hochvakuum-Modus. Slice-Schritten festgelegt werden solltenbei 70 nm oder weniger. </li><li> Sammeln SBEM-Daten im 16-Bit-.dm3 Format. </li></ol> 10. Optimieren SBEM Images für Oberflächensegmentierung <ol><li> Konvertieren SBEM Bilder von rohen .dm3 Format in 8-Bit-TIFF. </li><li> TIFF Filtern von Bildern mit einem 0,8 Gaußsche Unschärfe-Filter in Fidschi. </li><li> Verkleinern Sie die Daten auf 25% der Originalgröße festgelegt und speichern Sie sie als TIFF-Stapel, die Menge an RAM-Speicher erforderlich, um den Satz zu behandeln minimieren. </li><li> Richten Sie den Stapel SBEM Bilder mit der Fidschi-Plugin &quot;linear Stapel Ausrichtung mit SIFT&quot; im Übersetzungsmodus und beschnitten mit der &quot;Ernte 3D&quot; Plugin. Hinweis: Cropping hilft, die Menge an RAM-Speicher erforderlich weiter verringert für die Segmentierung und Volume-Rendering. </li></ol> Daten Rendering in 3D 11. konfokale Mikroskopie <ol><li> Rekonstruieren z-Stapel mit der automatische treffen Modus des &quot;Oberflächen&quot; Werkzeug. 1D zeigt eine reconstruction jedes Kanals mit Hilfe der glatten Option, die Oberflächen-Bereich Detail auf 0,126 &amp; mgr; m und Schwellen als absolute Intensität. </li></ol> 12. Serienblock Gesicht SEM Hinweis: Die manuelle Datensegmentierung ist ein sehr zeitaufwändiges Verfahren und in Abhängigkeit von den Merkmalen, das Verfahren kann mehrere Wochen dauern gerendert werden. Die Segmentierung für die Videos und Figuren in Bohórquez et al. 2014 8 wurde manuell durchgeführt und dauerte etwa 500 Stunden der Arbeit. Es wird empfohlen, die wesentlichen Merkmale benötigen Rendering vor Beginn der Segmentierungsprozess zu priorisieren. Die Vorgehensweise ist wie folgt: <ol><li> Verwenden Sie die &quot;Oberflächen&quot; Werkzeug in Zeichenmodus und die &quot;Kontur&quot; -Option im Zeichenmodus von 50 ms bis Segment manuell und Volumen machte die Zelle von Interesse. </li><li> Spuren Konturen auf jede Scheibe der Zelle für glattere Rendering oder alle 5 Scheiben für schnelleres Rendering. </li><li> Export im FinaleAlter mit Hilfe der &quot;Schnappschuss&quot; Werkzeug bei einer Auflösung von 300 dpi oder mehr. </li></ol>

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Dr. Satish Medicetty ist Mitarbeiter von und erhält 100% Gehalt von Renovo Neural Inc; Allerdings bedeutet dies nicht des Autors Einhaltung JoVE Politik ändern auf den Austausch von Daten und Materialien. Kein Interessenkonflikt ist für Rest Autoren erklärt.

<html> Magen-Darm-Chemosensorik wird als ein aufregendes neues Gebiet in der biomedizinischen Forschung entstehen. Dies ist zum großen Teil aufgrund der Entdeckung der funktionellen Geschmacksrezeptoren in enteroendokrinen Zellen 18. Nachfolgende Studien haben gezeigt, dass enteroendokrinen Zellen exprimieren Rezeptoren für bestimmte Nährstoffe, einschließlich Kohlenhydraten, Lipiden und Aminosäuren 5,6,19,20. Die katalytische Faktor für diesen Entdeckungen wurde die Entwicklung von Reporter Mäusen, bei denen enteroendokrinen Zellen fluoreszierend markiert 20. Wir entwickelten eine dieser Mäuse, die PyyGFP Maus, um enteroendokrinen Zellen des distalen Dünndarm und Dickdarm 17,21 studieren. Diese Zellen sind von Interesse, weil sie PYY und Glucagon-like Peptid 1, wobei beide Induktoren Sättigungs 22,23 absondern. Zu der Zeit, eine komplette Ultrastruktur Konto dieser Zellen fehlte, die wir glaubten, war notwendig, um die Signalmechanismen zu verstehen. NHALT &quot;&gt; Hier haben wir beschrieben, eine optisch ein Verfahren zur konfokalen Mikroskopie mit SBEM überbrücken. Die Methode wird als Cocem3D, die uns um die komplette Ultrastruktur von Zellen enteroendokrinen dokumentieren. Wir haben berichtet, dass diese Zellen eine neuropod, die drei- enthält zugelassen bezeichnet Viertel aller sekretorischen Vesikeln 8. Im neuropod gibt Neurofilamente und ähnlich wie neuronale Axone werden neuropods durch Darm Gliazellen 8 gefördert. Noch wichtiger ist es, obwohl diese neuropods das Zellen enteroendokrinen physische Verbindungen mit Neuronen innerviert den Darm und Doppelpunkt 9. Eine der Stärken der cocem3D ist seine Einfachheit. Verringern der Gewebeprobe in einen Block, der durch konfokale abgebildet werden kann und SBEM erleichtert die Identifizierung einer bestimmten Zelle in einem Gewebe. Sekretorischen Vesikeln und anderen Organellen mit Leichtigkeit bei einer Auflösung von 7 nm / Pixel identifiziert werden. Da die Abschnitte in SBEM werden verworfen, weitere processingen von Geweben, um spezifische Proteine ​​zu identifizieren ist keine Option an dieser Stelle. Jedoch ist die Entwicklung von Methoden wie ATUM 24, wobei Abschnitte von dem Gewebe-Block erhalten werden, geeignet sind, die Identifizierung von spezifischen Proteinen in der Zelle zu ermöglichen. Bestimmung der spezifischen Lage der chemosensorische Rezeptoren auf enteroendokrinen Zellen wesentliche Informationen für die Entwicklung von Arzneimitteltherapien für Übergewicht, weil enteroendokrinen Zellen sind eine sensorische Schnittstelle zwischen Nahrung im Darm und das Sättigungsgefühl im Gehirn.

Das Leben in einer Zelle stattfindet, in Zeit und Raum. Veränderungen über die Zeit oft mit Zeitraffer-Mikroskopie eine bildgebende Verfahren, wie Super-Resolution-Mikroskopie untersucht. Raum, insbesondere die Anordnung von Organellen innerhalb einer Zelle oder Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen, kann nur durch eine vollständige Darstellung der Feinstruktur der Zelle abgeleitet werden. Eine umfassende Darstellung der Feinstruktur einer Zelle kann auch Klarheit, um genomische Funktion bringen in Fällen, in denen das Genom vorhanden ist, wie die C. elegans Nematoden-1 oder die flache Placozoa tricoplax adherens 2. Serienschnittelektronenmikroskopie ist nun eine reproduzierbare, zeiteffizient und weniger kostspielige Aufgabe dank der Entwicklung von automatischen 3D Elektronenmikroskopie Technologien wie serielle Block-face Rasterelektronenmikroskop 3 (SBEM). Der Bedarf an Strukturinformationen zur Funktion aufzuklären ist sehr offensichtlich in bestimmten cell Typen, bei denen Funktion hängt von physikalischen Zellen-Zellen-Wechselwirkungen, wie Neuronen, Gliazellen oder sensorischen Epithelzellen. Wir sind besonders daran interessiert, bei der Aufklärung, wie sensorische Signale von Nährstoffen in das Lumen des Darms werden in ein elektrisches Signal, das letztlich moduliert appetitive Verhaltensweisen transduziert. Der Schaltkreis ist komplex, aber beginnt an der Darmwand, wo Nährstoffe in Kontakt mit sensorischen Epithelzellen, genannt enteroendokrinen Zellen kommen. Im Gegensatz zu anderen sensorischen Epithelzellen, wie Geschmackszellen werden enteroendokrinen Zellen im ganzen Darmepithel in einem Verhältnis von eins bis eintausend 4-7 dispergiert. Folglich waren sie schwer zu identifizieren und zu untersuchen, und für lange Zeit wurden sie nur als eine Quelle von Darmhormone angesehen. Aber mit der Entwicklung zellspezifischer Fluoreszenzreportermäusen, die komplexe sensorische Funktion dieser Zellen entsteht. Mit einer der folgenden Reporter Mäusen ein Peptid YY-GFP (PyyGFP) Maus, fanden wir, dass enteroendocrine Zellen eine herausragende cytoplasmatischen Schwanz, die wir mit dem Namen neuropod. Das Aussehen der neuropods vorgeschlagen eine konservierte Funktion von Zelle-zu-Zell-Kommunikation. Somit begründet, daß wir durch die Dokumentation der Ultrastruktur eine enteroendokrine Zelle, deren Funktion neuropods abgeleitet werden konnte. Die Notwendigkeit, die Struktur von einem Fortsatz in einer Zelle verteilt, die schwer zu erkennen, ist zu verstehen war der Hauptgrund für die Entwicklung eines Verfahrens zur konfokalen Mikroskopie und SBEM kombinieren. Die Zelle von Interesse wurde mit PyyGFP enteroendokrinen zellspezifische Reporter Mäusen identifiziert. Das Verfahren erlaubt es uns, die gesamte Ultra eines enteroendokrine Zelle und ihrer neuropod dokumentieren. Innerhalb neuropods fanden wir strukturellen Merkmale neuronalen Axonen und außerhalb neuropods, fanden wir eine physikalische Beziehung zu ente Glia 8. Tatsächlich enthalten neuropods etwa 70% aller sekretorischen Vesikeln vermutlich eine wesentliche Rolle bei der sekretorischen Funktion dieser Zellen. Aufbauend auf dieStrukturdaten, in jüngerer Zeit fanden wir, dass durch diese neuropods, enteroendokrinen Zellen und Neuronen innerviert den Darm bilden eine neuroepitheliale Schaltung, ähnlich der von Geschmackszellen in der Zunge 8,9. Aufdeckung solcher Merkmale von Magen-Darm chemosensory Mechanismen ergab sich aus Strukturdaten gesammelt mit diesen korrelative Mikroskopie-Methode. Wir glauben, dass diese Methode auch in anderen Gebieten der Zellbiologie, der besonders bei der Zellen im Gewebe zu einem sehr geringen Verhältnis verteilt werden. Wir bezogen auf die Verfahren nach Korrelat konfokalen und Serienblockfläche Rasterelektronenmikroskopie in 3D (Cocem3D). Das Verfahren besteht aus den folgenden Hauptschritte umfasst: Gewebedissektion, Konfokalmikroskopie SBEM Bildgebung SBEM und konfokaler Bildkorrelation und manuelle Segmentierung. Im Vergleich zu anderen korrelative Verfahren ist das Konzept nicht einfach, weil die Korrelation physikalischen anstatt Chemikalie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>4%, freshly made in PBS, final pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting agarose</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16520-100</td>
			<td>5%, freshly made in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62534-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160; nuclear stain</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postively charged glass slides and coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine art paintbrush #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 kit&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid releasing agent&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid silver colloidal&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CircuitWorks conductive epoxy&#160;&#160;</td>
			<td>ITW Chemtronics</td>
			<td>CW2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable flow peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT1200S Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 780i confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma VP Scanning Electron Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3view system</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)</td>
			<td></td>
			<td>http://www.renovoneural.com</td>
			<td>Renovo provides 3d EM services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>Open access software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer station with 16GB of RAM or more</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data visualization software Imaris 7.5&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative confocal and 3d electron microscopy of a specific sensory cell

Abgrenzung der Ultrastruktur der Zelle ist für das Verständnis der Funktion. Dies kann eine schwierige Projekt für seltene Zelltypen im ganzen Gewebe der verschiedenen Zelltypen, wie enteroendokrinen Zellen des Darmepithels gemacht diffundieren. Diese gastrointestinalen Sensoren von Lebensmitteln und Bakterien waren schwierig zu untersuchen, da sie unter anderen epithelialen Zellen in einem Verhältnis von 1 dispergiert sind: 1,000. Kürzlich transgene Reportermäusen erzeugt wurden, um Zellen zu identifizieren enteroendokrinen mittels Fluoreszenz. Eines davon ist das Peptid YY-GFP-Maus. Mit dieser Maus, ein Verfahren zur konfokalen und Serienblock-face Rasterelektronenmikroskopie korrelieren entwickelten wir. Wir nannten das Verfahren cocem3D und wendete sie auf eine bestimmte enteroendokrinen Zelle im Gewebe erkennen und zu enthüllen, Ultrastruktur der Zelle in 3D. Die Auflösung cocem3D ist ausreichend, um Organellen für Volumenwieder identifizieren so klein wie sekretorischen Vesikeln und zu unterscheiden, Zellmembranenndering. Cocem3D leicht angepasst, um die 3D-Ultrastruktur von anderen spezifischen Zelltypen in ihrer Muttergewebe zu untersuchen.

Das hier vorgestellte Verfahren wurde verwendet, um die Ultrastruktur von einer bestimmten Zelle innerhalb einer Epithelschicht studieren. Die Zelle von Interesse ist in diesem Fall das schwer fassbare enteroendokrinen Zelle. Ihre Identifikation in situ wurde erst in den letzten Jahren mit der Entwicklung von zellspezifischen Fluoreszenzreportermäusen möglich. Im Jahr 2011, haben wir eine Maus, bei der der Promotor des Hormons PYY treibt die Expression des grün fluoreszierenden Proteins 17. In diesem PyyGFP Maus werden enteroendokrinen Zellen des distalen Teils des Dünndarms und des Dickdarms leicht unter UV-Licht aus. Das Maus-Modell war ein Grundstein, um einen Gewebeblock, die ein enteroendokrinen Zelle erkennen und verarbeiten es für SBEM. Das Korrelationsverfahren wird hier als cocem3D bezogen und auf der zuvor veröffentlichten Protokollen 10,11 aufgebaut. Optimierung der Abmessungen der Gewebeblocks ist kritisch für die Korrelation. In Vorversuchenes wurde festgestellt, dass in einem Gewebeblock 300 &amp; mgr; m lang x 50 um dick die Anzahl der SBEM Bilder wird auf ein Minimum reduziert, während die den gesamten Körper der Zelle von Interesse. 1A zeigt einen Overlook der Dissektion mit einem Schwingklinge microtrome zu erhalten die Gewebeblock mit den richtigen Abmessungen. Mindestens 100 Blöcke werden vor dem Sortieren durch sie an Menschen mit intakten Zellen von Interesse holen erhalten. Ausgewählten Blöcke durch konfokale Mikroskopie und Bild z-Stapel abgebildet werden optisch beabstandet jeden 1 &amp; mgr; m (1B und C). 1D zeigt eine volumenwiederAnsicht einer enteroendokrine Zelle im Ileum der Maus. Seine herausragende neuropod sich unterhalb Epithelzellen für ~ 60 &amp; mgr; m. Die Zelle von Interesse wird durch Korrelation der konfokalen z-Stacks mit einer SBEM Bild des gesamten Blockfläche gefunden. Ein Beispiel ist hier aus einem Block aus dem distalen Kolon eines PyyGFP vorgestelltMaus. Nach Erhalten konfokalen Z-Stapel (2A), wird der Block in einer dünnen Schicht von Agarose mit niedrigem Schmelz (2B) eingebettet. Dies ist für die nachfolgende Bearbeitung des Blocks erforderlich. Es ist wichtig, die Ausrichtung des Blocks so flach wie möglich, um die optischen Scheiben mit den Scheiben SBEM übereinstimmen aufrechtzuerhalten. In 2C wird ein repräsentatives Bild von der gesamten Fläche der Gewebeblock gezeigt. Teile dieser Figur wurden zuvor in Bohorquez et al., 2014 8. Dieses wurde anschließend mit dem konfokalen Bild unter Berücksichtigung Teilpunkte und Maße korreliert. 2D zeigt eine Überlagerung der konfokalen und SBEM Bild des Blocks und enthüllt die genaue Lage unserer Zelle von Interesse. Sobald die Zelle identifiziert wurde, wird SBEM Bildgebung bei einer Auflösung hoch genug, um sekretorischen Vesikeln und anderen Zellorganellen zu identifizieren getan. Der Datensatz präsentierte erre wurde bei 7 nm pro Pixel abgebildet wird, wie Bilder des Blocks wurden alle 70 nm gemacht. Der Datensatz enthält 643 Bilder, 45 um der Gewebetiefe erstrecken. Wenige Mikrometer sind während der anfänglichen Bilderzeugung der gesamten Blockfläche bei geringer Vergrößerung rasiert. Die rohe SBEM Datensatz wurde in .dm3 Format erworben und TIFF für nachfolgende Handhabung umgewandelt. Die SBEM Stapel wurde mit der Fidschi Software-Plugin &quot;crop (3D)&quot; Block, nur den Bereich von Interesse enthalten, abgeschnitten. Dies reduziert die Menge an RAM-Speicher für Volumenberechnungen notwendig. Die Zelle wurde durch seine Position und sekretorischen Vesikeln identifiziert und segmentiert Verwendung Imaris Software, Fig. 3 enthält eine Wiedergabe in 3D des enteroendokrine Zelle. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig1.jpg" /> Abb. 1: Correlative Konfokalmikroskopie (A) Arbeitsablauf, um ein Stück zu sezierenDarmgewebe in ein Gewebe Block 300 x 50 &amp; mgr; m dick. (B) Eine repräsentative Gewebeblock der richtigen Dimensionen. Man beachte, dass ein Gewebeblock dieser Dimensionen aus der Maus Dünndarm erstreckt sich über etwa 3 Zotten oder im Falle des Kolons etwa 8 Krypten. (C) Eine Zotten des Dünndarms, die eine Zelle von Interesse. (D) Ein konfokales Z-Stapel in 3D mit Imaris Software gerendert zeigt eine enteroendokrine Zelle mit einem prominenten neuropod unterhalb des Darmepithels läuft. Blau = DAPI Kernfärbung. Bars = 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig2.jpg" /> Figur 2: Serienblockfläche Rasterelektronenmikroskopie (A) konfokale Bild Fischspeziali.cted Gewebeblock aus dem Dickdarm PyyGFP enteroendokrinen Zellen (grün) von Interesse enthält. (B) Wenn der Block durch konfokale Mikroskopie abgebildet werden, es wird dann flach in niedrig schmelzenden Agarose unter Verwendung von Glasplättchen eingebettet. Einbetten der Gewebeblock in Agarose erleichtert anschließende Manipulation und die Kerbe in der linken Ecke hilft, den Block innerhalb des SBEM in der richtigen Orientierung zu montieren. (C) SBEM Bild des Gesichts des Blocks. (D) Korrelation der Daten mit konfokalen SBEM zu Zelle von Interesse (weißer Pfeil) zu identifizieren. Bilder c und d der Figur sind aus Bohorquez et al. Modifiziert 2014 8. Blau = DAPI Kernfärbung. Bars = 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig3.jpg" /> Abb. 3: Die Daten in 3D-Rendering (A) Volume-Rendering enteroendokrinen Zelle mit Imaris Software. Die Zelle enthält eine neuropod mit sekretorischen Vesikeln verpackt. Für eine vollständige Beschreibung der Ultrastruktur einer Zelle enteroendokrinen Sie bitte Bohórquez et al., 2014 8 beziehen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Korrelat konfokale und 3D-Elektronenmikroskopie eines spezifischen Sinneszelle

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

correlative-confocal-3d-electron-microscopy-specific-sensory

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Aufrufe.  Duke University Medical Center. Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy. 

Serie: Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Forschung

Biologie

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity necessary for proper cellular function. Understanding how the enzymes, proteins, and cytoskeletal components govern and maintain this biochemical segregation is therefore of paramount importance. The use of fluorescently tagged molecules to localize to and/or perturb subcellular compartments has yielded a wealth of knowledge and advanced our understanding of cellular regulation. Imaging techniques such as fluorescent and confocal microscopy make ascertaining the position of a fluorescently tagged small molecule relatively straightforward, however the resolution of very small structures is limited 1.
On the other hand, electron microscopy has revealed details of subcellular morphology at very high resolution, but its static nature makes it difficult to measure highly dynamic processes with precision 2,3. Thus, the combination of light microscopy with electron microscopy of the same sample, termed Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, affords the dual advantages of ultrafast fluorescent imaging with the high-resolution of electron microscopy 6. This powerful technique has been implemented to study many aspects of cell biology 5,7. Since its inception, this procedure has increased our ability to distinguish subcellular architectures and morphologies at high resolution. 
Here, we present a streamlined method for performing rapid microinjection followed by CLEM (Fig. 1). The microinjection CLEM procedure can be used to introduce specific quantities of small molecules and/or proteins directly into the eukaryotic cell cytoplasm and study the effects from millimeter to multi-nanometer resolution (Fig. 2). The technique is based on microinjecting cells grown on laser etched glass gridded coverslips affixed to the bottom of live cell dishes and imaging with both confocal fluorescent and electron microscopy. Localization of the cell(s) of interest is facilitated by the grid pattern, which is easily transferred, along with the cells of interest, to the Epon resin used for immobilization of samples and sectioning prior to electron microscopy analysis (Fig. 3). Overlay of fluorescent and EM images allows the user to determine the subcellular localization as well as any morphological and/or ultrastructural changes induced by the microinjected molecule of interest (Fig. 4). This technique is amenable to time points ranging from &le;5 s up to several hours, depending on the nature of the microinjected sample.

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The CLEM technique has been adapted to analyze ultrastructural morphology of membranes, organelles, and subcellular structures affected by microinjected molecules. This method combines the powerful techniques of micromanipulation/microinjection, confocal fluorescent microscopy, and electron microscopy to allow millimeter to multi-nanometer resolution. This technique is amenable to a wide variety of applications.

Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM) als Werkzeug zur Visualisierung mikroinjiziert Moleküle und ihre Eukaryotic Sub-zellulären Targets


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Kryo-elektronenmikroskopische Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Studien mit einem neuartigen Robotersystem, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

Probenvorbereitung durch 3D-korrelatives fokussiertes Ionenstrahlfräsen für die hochauflösende Kryo-Elektronentomographie

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal details that are important for understanding the autophagic process. However, EM methods often lack molecular information, obstructing the correlation of ultrastructural information obtained by EM to fluorescence microscopy-based localization of specific autophagy proteins. Furthermore, the rarity of autophagosomes in unaltered cellular conditions hampers investigation by EM, which requires high magnification, and hence provides a limited field of view.
In answer to both challenges, an on-section correlative light-electron microscopy (CLEM) method based on fluorescent labeling was applied to correlate a common autophagosomal marker, LC3, to EM ultrastructure. The method was used to rapidly screen cells in fluorescence microscopy for LC3 labeling in combination with other relevant markers. Subsequently, the underlying ultrastructural features of selected LC3-labeled spots were identified by CLEM. The method was applied to starved cells without adding inhibitors of lysosomal acidification.
In these conditions, LC3 was found predominantly on autophagosomes and rarely in autolysosomes, in which LC3 is rapidly degraded. These data show both the feasibility and sensitivity of this approach, demonstrating that CLEM can be used to provide ultrastructural insights on LC3-mediated autophagy in native conditions-without drug treatments or genetic alterations. Overall, this method presents a valuable tool for ultrastructural localization studies of autophagy proteins and other scarce antigens by bridging light microscopy to EM data.

Here, we present a protocol for optimized on-section correlative light-electron microscopy based on endogenous, fluorescent labeling as a tool to investigate the localization of rare proteins in relation to cellular ultrastructure. The power of this approach is demonstrated by ultrastructural localization of endogenous LC3 in starved cells without Bafilomycin treatment.

Ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 mittels korrelativer Lichtelektronenmikroskopie

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Bildgebung von mitochondrialem Peroxid in lebenden Hefezellen mit mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

Autor im Rampenlicht: Advancing Mitochondrial Research - mtHyper7 Biosensor für die subzelluläre Analyse 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

Bildgebung von mtHyPer7, einem ratiometrischen Biosensor für mitochondriales Peroxid, in lebenden Hefezellen

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...