31301950 und 31671288: Dieses Projekt wurde von der National Natural Science Foundation of China (NSFC) unterstützt.

Die aktuelle Methode wurde entwickelt und validiert zu ernten und lagert mehr als 1.000 Muskelproben zur histologischen Färbung in unserem Labor. Alle Verfahren beteiligen Tierpflege und Verwendung folgten die vom Ministerium für Landwirtschaft von China festgelegten Richtlinien. 1. Ausrüstung für die Probenentnahme <ol><li> Beschriften Sie die Probe Identität auf jeder kryogenen Fläschchen. Hinweis: Die Kryo - Fläschchen speziell frische Gewebeproben für das Kryoschnittes Verfahren (Abbildung 1A) einzufrieren ausgelegt ist. Die Fläschchen werden aus Polypropylen in einer Form Fabrik (1C) gebildet. </li><li> Erhalten, die folgende Ausrüstung: flüssigen Stickstoff in einem geeigneten Flüssigstickstofftank, eine Schutzbrille oder einen Gesichtsschutz, Gefriertruhe Handschuhe, 10 cm Zange 25 cm Pinzette, eine Styropor-Kühler (innere Abmessungen: 20 cm lang x 12 cm breit x 13,5 cm hoch Außenabmessungen;: 24 cm lang x 16 cm breit x 15 cm hoch), Kunststofffolien (2,5 cm lang x 0,8 cm breit x 0,1 mm dick),ein Skalpell, und A4 PVC Bindungsabdeckungen (21 cm x 29,5 cm) (1B). </li></ol> 2. Herstellung von Muskelproben <ol><li> Füllen Sie das Styropor-Kühler mit flüssigen Stickstoff 5 min vor der Probenentnahme. HINWEIS: Die große Säule von flüssigem Stickstoff ist wichtig, weil ein Teil des flüssigen Stickstoffs verkocht und verwandelt sich in Gas, wenn frische Proben berühren. Um die Häufigkeit der Übertragung von flüssigem Stickstoff zu reduzieren, um den Verlust, ein entsprechend dimensioniertes Styropor-Kühler aufzufüllen muss entsprechend der Anzahl von Abtastwerten im Voraus erfasst werden. </li><li> Sobald eine Probe erhalten wird, ist es leicht Platz auf einem Stück PVC-Bindungs ​​A4 Abdeckung und die Richtung der Muskelfasern beobachten. HINWEIS: Hier haben wir den Querschnitt des longissimus doris Muskel von der ersten bis zur letzten Lendenwirbel bei Schweinen. Die Proben sind etwa 12 cm lang, 8 cm breit und 5 cm hoch. </li><li> Verwenden eines Skalpells zwei parallele Schnitte durch die Probe i zu machenn die Richtung der Muskelfasern, etwa 3 cm lang und 0,6 cm auseinander liegen. Schneiden Sie den eingeschnittene Muskel in ein Rechteck ungefähr 0,6 cm breit x 0,6 cm x 1,5 cm lang. HINWEIS: Die Zuverlässigkeit der Messung der Querschnittsfläche der Muskelfasern hängt vor allem von der Faserorientierung des eingeschnittenen Muskel. </li><li> 10 cm verwenden Pinzette vorsichtig auf die Probe stellen auf einem Stück Kunststofffolie, die mit der Längsachse des eingeschnittenen Muskel parallel zur langen Kante des Films (2A). HINWEIS: Der Kunststofffilm hat zwei Funktionen: eine Haltefunktion, die bei der Festlegung der Ausrichtung der Muskelfasern und eine Haftfunktion hilft, dass Risse in der Probe aufgrund des schnellen Einfrierens verhindert. </li><li> Mit einer Pinzette, legt das Muskelgewebe in die untere Mitte eines Kryoröhrchen gekennzeichnet, genau zwischen den Einlasslöchern und dann fest verschließen die Phiole (2B). </li></ol> 3. Einfrieren und Speichern von Muskelprobes <ol><li> Unter Verwendung von 25 cm Pinzette, unterzutauchen schnell das gesamte Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff in dem vorgekühlten Styroporkühler, zu warten, bis der flüssige Stickstoff nicht siedet (ungefähr 10-20 s). HINWEIS: Die Cryovial schwimmt, wenn der flüssige Stickstoff kocht, so sorgfältig das Fläschchen in dem siedenden Flüssigkeit Stickstoff taucht für 10-20 s. </li><li> Übertragen der Muskelproben zu einer Flüssigstickstofflagertank oder ein -80 ° C-Gefrierschrank für die Langzeitlagerung. </li></ol> 4. Schieben Vorbereitung <ol><li> Vorkühlen eines Kryostaten auf zwischen -20 ° C und -22 ° C. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie die alte Mikrotom-Klinge, wischen Sie den Messerhalter und Treckerplatte im Kryostaten, ein neues Mikrotomklinge im Kryostaten installieren, und stellen Sie die Schnittstärke bis 8 um. </li><li> Übertragen der Muskelprobe in der Kryoröhrchen aus dem Flüssigstickstofflagertank oder -80 ° C Gefrierschrank zu dem Kryostaten, es in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis transportiert. </li&gt; <li> Warte 30 min für die Probe mit der Temperatur des Kryostaten äquilibrieren. HINWEIS: Alle Geräte, die die Probe berühren könnten, muß vorgekühlt werden, da eine hohe Temperatur könnte die Bildung von Eiskristallen in der Probe führen. </li><li> Montieren der Probe in der Probenhalter unter der optimale Schnitttemperatur Formulierung von wasserlöslichen Glykolen und Harze (OCT). Geschnitten 8-um-Schnitte. HINWEIS: Einstellen der Schnittwinkel senkrecht zur Ausrichtung der Muskelfasern, weil die CSAF die Querschnittsfläche der Muskelfasern ist. </li><li> Montieren Sie die Abschnitte in Richtung der Mitte einer Raumtemperatur Mikrodia. unmittelbar die Folie in eine Folie Box in einem -80 ° C-Gefrierschrank. Halten Sie das Dia bei RT trocknen. </li></ol>

<ol>
	<li>Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+fresh+meat+quality+through+manipulation+of+muscle+fiber+characteristics.">Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics.</a> Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).</li><li>Lefaucheur, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+look+into+fibre+typing--relation+to+meat+quality.">A second look into fibre typing--relation to meat quality.</a> Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).</li><li>Fiems, L. 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K., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , (2008).</li><li>Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bubbles+Size+Estimation+in+Liquid+Flow+Through+a+Vertical+Pipe.">Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe.</a> J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).</li><li>Fukutomi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Study+of+A+Flow+through+Small+Apertures+:+2nd+Report,+Experiments+on+The+Velocity+Field.">A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field.</a> Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).</li><li>Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. 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Keine Interessenkonflikte, finanzielle oder sonstige, werden von den Autoren erklärt.

Hier beschreiben wir ein neues, Mehrloch Kryoröhrchen zum Einfrieren und Speicher von Muskelgewebe zu histologischer Beurteilung der Muskelfunktion führen. Der kritische Schritt in diesem modifizierten Protokoll ist, dass die Probe in den Mehrloch-Kryoröhrchen direkt in flüssigem Stickstoff eingetaucht ist. Unser Wissen ist dies die einfachste und rapidest Art und Weise ausgezeichnete gefrorene Proben für Muskel Kryoschneiden unter den bestehenden Gefrierverfahren zu erhalten (siehe die repräsentativen Ergebnisse)...

Der Skelettmuskel ist das wertvollste Komponente eines fleischproduzierenden Tieres aus der Ernährungs- und verarbeitungstechnischer Sicht. In der Fleischindustrie gibt es zwei besonders kritische Aspekte: die Effizienz des Muskelwachstums und der Qualität des resultierenden Fleisch. Als Hauptbestandteil des Muskels, sind Muskelfasern zu Wachstum und frische Fleischqualität 1 bei Tieren direkt in Zusammenhang steht. Zum Beispiel ist die Gesamtanzahl von Fasern (TNF) und die Querschnittsfläche der Fasern (CSAF) meist Muskelmasse und Fleischqualität bestimmen; auch, Fasertyp Zusammensetzung (FTC) wirkt sich stark auf frische Fleischqualität 2. Daher ist die Manipulation von Muskelfasereigenschaften bei Tieren eine sehr wirksame Methode 1 den Kern der Rentabilität und die Wettbewerbsfähigkeit der Betriebe zu erhöhen. Bis heute wurden mehrere intrinsische und extrinsische Faktoren identifiziert worden, Muskelfaser characterist zu manipulierenics 1. Diese Manipulation kann durch die gezielte Auswahl von Tieren mit spezifischen Genen, wie die Myostatin - Gene in cattle 3, das Callipyge Gen in sheep 4 und die RYR1 und IGF2 Gene in pigs 5 erreicht werden. Auch Ernährung Kontrolle und Behandlungen mit spezifischen Hormone spielen eine wichtige Rolle bei der Muskelfasereigenschaften 6. So ein Ansatz, die genetischen und Ernährungsfaktoren kombiniert könnte Muskelfleischanteil und Fleischqualität verbessern kann. Allerdings Studien über Muskelfasern sind in der Fleischindustrie, weil die Aufklärung der Struktur von Muskelfasern begrenzt noch eine Herausforderung. Muskelfasereigenschaften werden unter Verwendung histochemischer Methoden, wie beispielsweise die Myosin Adenosintriphosphatase (ATPase) -Assay identifiziert. Dieses Verfahren beruht auf der Tatsache, dass die in dünnen (6-8 um) gefroren Abschnitte angeordnet EnzymeMuskelfasern chemisch reagiert mit bestimmten Produkten werden kann. Jedoch ist der Wassergehalt der Muskeln mehr als 75% bei Schweinen, Kaninchen, Mäusen und Menschen, unabhängig von der Position ( das heißt, Rücken, Bauch oder hinteren Gliedmaßen) 7. Solche hohen Feuchtigkeitsgehalt in Muskeln verursacht eine häufig auftretende Problem - Einfrieren Artefakte - bei der Herstellung von Gefrierschnitten, wie zuvor beschrieben , 8, 9. In den meisten Fällen ist es fast unmöglich, in geeigneter Weise zu Muskelgewebe in einem Schlachthof Produktionslinie, nach unserer Erfahrung einzufrieren. Das Protokoll hier vorgestellten beschreibt ein einfaches und effizientes Verfahren in unserem Labor verwendete Muskelgewebe einzufrieren für in einer Hochdurchsatz-Art und Weise Kryoschneiden. Der Höhepunkt dieses Verfahrens ist ein neues, die für Flash-Kryoröhrchen Frieren Muskelgewebe in flüssigem Stickstoff ausgelegt ist. Der aktuelle Workflow kann gleichzeitig Gewebe erleichternEinfrieren und die Verarbeitung für einen ausgezeichneten Muskel Kryoschnitt, mit einem deutlich sichtbar cytoplasmatischen Kompartiment und der engen Apposition von Muskelfasern an das umgebenden Gewebe. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf eine breite Palette von Möglichkeiten für Gewebeanalyse angewendet werden, da flüssiger Stickstoff mit Gewebe nicht mischen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="508">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">Cryostat Microtome</td>
			<td style="width:111px;">&#160;Leica</td>
			<td style="width:111px;">Leica CM1950</td>
			<td style="width:148px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon DS-U3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:140px;">&#160;Cryogenic Vial&#160;&#160; Plastic film</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Designed by ourself</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cm-forcep</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25cm-tweezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Safety glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freezer gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-hole cryovial eliminates freezing artifacts when muscle tissues are directly immersed in liquid nitrogen

Studien über die Skelettmuskelphysiologie stehen vor der technischen Herausforderung, in geeigneter Weise die Proben Verarbeitungsabschnitte mit deutlich sichtbaren cytoplasmatischen Kompartimenten zu erhalten. Eine weitere Hürde ist die enge Apposition von Muskelfasern zu den umliegenden Geweben. Da der Prozess der Gewebefixierung und Paraffineinbettung der Schrumpfung von Muskelfasern führt, Gefrieren ist ein optimales Mittel zum Härten Muskelgewebe zur Sektionierung. Allerdings ist ein häufig auftretendes Problem, die Bildung von Eiskristallen, tritt während der Herstellung von Gefrierschnitten aufgrund des hohen Wassergehalt des Muskels. Das Protokoll hier vorgestellte erste beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Muskelgewebe richtig Einfrieren, indem sie in flüssigem Stickstoff eingetaucht wird. Das Problem bei der Verwendung von flüssigem Stickstoff allein ist, dass es die Bildung einer Stickstoffgasbarriere bewirkt neben das Gewebe, das als Isolator wirkt und hemmt die Kühlung der Gewebe. Um dies zu vermeiden „Dampfdecke“ -Effekt, ein new Kryoröhrchen wurde entwickelt, um die Geschwindigkeit der Flüssigkeitsströmung um die Gewebeoberfläche zu erhöhen. Dies wurde durch Stanzen eines insgesamt 14 Einlassöffnungen in der Wand des Fläschchens erreicht. Nach Blasendynamik, eine höhere Rate des Flüssigkeitsstrom führt zu kleineren Blasen und weniger Chancen eine Gasbarriere zu bilden. Wenn flüssiger Stickstoff die Kryoröhrchen durch die Einlasslöcher strömt, ist die Strömungsgeschwindigkeit um das Gewebe schnell genug, um die Gasbarriere zu beseitigen. Im Vergleich zu dem Verfahren von Muskelgewebe Einfrieren unter Verwendung von vorgekühltes Isopentan, ist dieses Protokoll einfacher und effizienter und kann verwendet werden, Muskel in einem Durchsatz Weise einzufrieren. Darüber hinaus ist dieses Verfahren optimal für Institutionen, die keinen Zugang zu Isopentan haben, die bei Raumtemperatur extrem leicht entflammbar ist.

Die Kryoröhrchen Illustration und die gemeinsamen für Laborgeräte Muskeln während der Herstellung von Gefrierschnitten Einfrieren sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Kryoröhrchen sind aus Polypropylen in einer Form Fabrik. Jedes Fläschchen hat insgesamt 14 Einlasslöcher: Ein an der Kappe ist; eine andere ist an der Unterseite; und die verbleibenden 12 bilden vier parallele Leitungen, die jeweils mit vier Bohrungen um 90 ° zueinander. Diese Einlasslöcher können...

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A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren Muskelgewebe einzufrieren, indem sie direkt in flüssigen Stickstoff tauchen. Dieses Protokoll zeigt auch eine neue Cryovial, die den „Decke-Effekt“ von Stickstoffgas, wenn flüssiger Stickstoff in Kontakt mit der Gewebeoberfläche einer Probe zu vermeiden.

Ein Multi-Loch Cryovial Eliminiert Einfrieren Artefakte, wenn Muskelgewebe wird in flüssigem Stickstoff direkt tauchend

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

a-multi-hole-cryovial-eliminates-freezing-artifacts-when-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Aufrufe.  Jiangxi Agricultural University.  Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren Muskelgewebe einzufrieren, indem sie direkt in flüssigen Stickstoff tauchen. Dieses Protokoll zeigt auch eine neue Cryovial, die den „Decke-Effekt“ von Stickstoffgas, wenn flüssiger Stickstoff in Kontakt mit der Gewebeoberfläche einer Probe zu vermeiden. 

Serie: A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Freezing Human ES Cells

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove residual media that could otherwise quench the Trypsin reaction.  Warmed 0.05% Trypsin-EDTA is then added to cover the cells, and the plate allowed to incubate for up to 5 mins at room temperature.  During this time cells can be observed rounding, and colonies lifting off the plate surface.  Gentle repeated pipetting will remove cells and colonies from the plate surface.  Trypsinized cells are placed in a standard conical tube containing pre-warmed hES cell media to quench remaining trypsin, and then spun.  Cells are resuspended growth media at a concentration of approximately one million cells in one mL of media, a concentration such that one frozen aliquot is sufficient to resurrect a culture on a 10cm plate.  After cells are adequately resuspended, ice cold freezing media is added at equal volume.  Cell suspensions are mixed thoroughly, aliquoted into freezing vials, and allowed to slowly freeze to -80C over 24 hours.  Frozen cells can then moved to the vapor phase of liquid nitrogen for long term storage, or remain at -80 for approximately six months.

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.

Einfrieren menschlicher ES-Zellen

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Forschung

Biologie

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Demonstrated in this video are the techniques for flash freezing and sectioning embryonic brain tissue from mouse. Useful tips for using the cryostat are given, including troubleshooting methods that can be used while cutting to ensure that the resultant tissues sections are free of cracks and other distortions.

Flash-Freezing und Kryoschneiden E12.5 Gehirn der Maus

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the structure, function, behavior, and biology of the cells in culture. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks. 

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks.

Einfrieren, Auftauen und Packaging Cells für Verkehr

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Einfrieren und Auftauen humanen embryonalen Stammzellen

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Aip1p Dynamics Are Altered by the R256H Mutation in Actin

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of fluorescently tagged proteins using total internal fluorescence (TIRF) microscopy is used to visualize and quantify changes in cytoskeletal dynamics. TIRF microscopy and the use of fluorescent tags also allows for quantification of the changes in cytoskeletal dynamics caused by mutations in actin. Using this technique, quantification of cytoskeletal function in live cells valuably complements in vitro studies of protein function. As an example, missense mutations affecting the actin residue R256 have been identified in three human actin isoforms suggesting this amino acid plays an important role in regulatory interactions. The effects of the actin mutation R256H on cytoskeletal movements were studied using the yeast model. The protein, Aip1, which is known to assist cofilin in actin depolymerization, was tagged with green fluorescent protein (GFP) at the N-terminus and tracked in vivo using TIRF microscopy. The rate of Aip1p movement in both wild type and mutant strains was quantified. In cells expressing R256H mutant actin, Aip1p motion is restricted and the rate of movement is nearly half the speed measured in wild type cells (0.88 &#177; 0.30 &#956;m/sec in R256H cells compared to 1.60 &#177; 0.42 &#956;m/sec in wild type cells, p &#60; 0.005).

Disease-causing mutations in actin can alter cytoskeletal function. Cytoskeletal dynamics are quantified through imaging of fluorescently tagged proteins using total internal fluorescence microscopy. As an example, the cytoskeletal protein, Aip1p, has altered localization and movement in cells expressing the mutant actin isoform, R256H.

Aip1p Dynamics werden von der R256H Mutation in Actin Altered

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Tissue Triage und Einfrieren der Modelle von Skelettmuskelerkrankungen

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid acquisition require assessing mouthpart structure and function relationships; however, fluid uptake mechanisms are historically inferred from observations of structural architecture, sometimes unaccompanied with experimental evidence. Here, we report a novel method for assessing fluid-uptake abilities with butterflies (Lepidoptera) and flies (Diptera) using small amounts of liquids. Insects are fed with a 20% sucrose solution mixed with fluorescent, magnetic nanoparticles from filter papers of specific pore sizes. The crop (internal structure used for storing fluids) is removed from the insect and placed on a confocal microscope. A magnet is waved by the crop to determine the presence of nanoparticles, which indicate if the insects are able to ingest fluids. This methodology is used to reveal a widespread feeding mechanism (capillary action and liquid bridge formation) that is potentially shared among Lepidoptera and Diptera when feeding from porous surfaces. In addition, this method can be used for studies of feeding mechanisms among a variety of fluid-feeding insects, including those important in disease transmission and biomimetics, and potentially other studies that involve nano- or micro-sized conduits where liquid transport requires verification.

Fluid-feeding insects have the ability to acquire minute quantities of liquids from porous surfaces. This protocol describes a method to directly determine the ability for insects to ingest liquids from porous surfaces using feeding solutions with fluorescent, magnetic nanoparticles.

Die Einnahme von Leuchtstofflampen, magnetische Nanopartikel für die Bestimmung der Fluid-Aufnahme Fähigkeiten bei Insekten

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...