Die Autoren danken Leif Oxburgh und Derek Adams für ihre Kenntnisse, Leif Oxburgh für die hilfreichen Kommentare zum Manuskript und Stefan Wölfl und Ulrike Müller für ihre technische Unterstützung und Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer und Viola Mayer für die Hilfe in der Labor. Diese Arbeit wurde von der Entwicklung, der Gesellschaft der Biologen (nach CP) unterstützt .

Die Mäuse wurden nach den schwedischen Vorschriften und den Rechtsvorschriften der Europäischen Union (2010/63 / EU) aufrechterhalten. Alle Verfahren wurden nach den Richtlinien des schwedischen Ethikausschusses durchgeführt (Genehmigungen C79 / 9, C248 / 11 und C135 / 14). Die Verfahren an der Universität Heidelberg mit Tierfächern wurden vom Regierungspräsidium Karlsruhe und den Tierschutzbeauftragten an der Universität Heidelberg genehmigt. 1. Vorbereitung von Reagenzien und Materialien für Kultur HINWEIS: Verwenden Sie eine laminare Strömungshaube, um die Kontamination zu minimieren. <ol><li> Am Tag der Sezierung wurde das menschliche Fc allein oder rekombinantes chimäres Ephrinprotein, das mit menschlichem Fc fusioniert ist, durch Mischen mit anti-humanen Fc-Ziegen-Antikörpern in einem Molverhältnis von 1: 5 in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt. 1 Stunde bei 37 ° C inkubieren 5 . </li><li> Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient ergänzenMischung F-12 (DMEM / F12) mit 1% Penicillin / Streptomycin (v / v), 1% Glutamin (v / v), 1% Insulin-Transferrin-Selen (v / v), 50 μg / ml menschliches Holo- Transferrin und 1,5 μg / ml Amphotericin. HINWEIS: 10 ml Medium reicht für 16 Embryonen aus. </li><li> Fügen Sie gruppierte rekombinante Ephrinlösung in einer Endkonzentration von 20 μg / ml zum Kulturmedium hinzu. Verwenden Sie Clustered Human Fc als Kontrolle. </li><li> Bereiten Sie Kulturplatten vor, indem Sie 500 &amp; mgr; l Kulturmedium zu jeder Vertiefung einer sterilen, unbeschichteten, flachen Boden-Polystyrol-4-Well-Platte hinzufügen. </li><li> Mit sterilen Pinzetten sorgfältig einen Polycarbonat-Membranfilter mit einer Porengröße von 5 μm pro Well auf das Medium legen. Übertragen Sie die vorbereitete Platte in den Inkubator (37 ° C / 5% CO 2 ). Stellen Sie sicher, dass der Filter auf der Oberseite trocken bleibt und schwimmt. HINWEIS: Ein Filter reicht für zwei Nierenanlagen aus. </li><li> Mit einer Rasierklinge schneiden Sie ca. 30 Pipettenspitzen (Volumen: 100 μl) approximatelY 1 mm von der Spitze, um zu einer breiteren Öffnung zu führen. Legen Sie die Spitzen wieder in ein Pipetten-Tip-Rack. </li></ol> 2. Dissektion von metanephrischen Rudimente bei E11.5 <ol><li> Opfer eine zeitlich-schwangere Maus bei E11.5 durch zervikale Versetzung (oder mit einer Methode, die von der lokalen Ethik-Ausschuss genehmigt). </li><li> Entfernen Sie den Uterus und die Embryonen, wie von Brown et al. 6 beschrieben. Von diesem Punkt aus, arbeiten Sie unter einem Sektionsmikroskop. </li><li> Mit der Nr. 5 Uhrmacherzange, schneide den Embryo direkt unter die Vorderbeine. Verwenden Sie für jeden Embryo eine frische Petrischale. Entfernen Sie die Beine und den Schwanz des Embryos. Um dies zu tun, greifen Sie das Gewebe mit einem Paar von Nr. 5 Uhrmacher Pinzette entfernt werden und verwenden Sie die Spitzen eines zweiten Paares zu schneiden. </li><li> Um die ventrale Organmasse zu entfernen, benutze die Spitzen einer Pinzette, um die Körperwand des Embryos in einer rostral-to-caudalen Richtung zu öffnen. <ol><li> Schnitt oberflächlich, parallel zu tEr dorsale aorta Verwenden Sie die Blut-gefüllte und daher sichtbare dorsale Aorta zur Orientierung. Sorgfältig trennen Sie den ventralen Teil der Körperwand von der dorsalen Teil mit den Spitzen der geschlossenen Pinzette und drehen Sie den Embryo über. Schneiden Sie die Körperwand seitlich in einer rostralen bis kaudalen Richtung und verwenden Sie die dorsale Aorta zur Orientierung, wie für die vorherige Seite. </li></ol></li><li> Sobald die ventrale Körperwand vom dorsalen Körper getrennt ist, packt sie mit einer Pinzette und zieht sie sorgfältig zusammen, um sie zusammen mit der Orgelmasse zu entfernen. HINWEIS: Die metanephrischen Anlagen bleiben gewöhnlich an der dorsalen Körperwand befestigt. Sie sind ovale, 200 μm lange Strukturen, die sich auf der Höhe der Hinterbeine befinden. </li><li> Halten Sie die dorsale Körperwand mit einer Pinzette, mit der ventralen Seite nach oben. Mit dem anderen Paar Pinzette, greifen die dorsale Aorta an seinem rostralen Ende und sorgfältig schälen die dorsale Aorta aus der dorsalen Körperwand. ANMERKUNG: Beide metanephrischen Nieren bleiben in der Regel angebrachtAuf die dorsale aorta </li><li> Mit einem Paar Pinzette, schneiden rostral auf die Niere anlagen, um die Aorta zu entfernen. Dann trennen Sie sorgfältig die beiden Niere anlagen mit den Spitzen der Pinzette. </li><li> Vorsichtig vor unerwünschtes Gewebe aus der Niere anlagen mit den Spitzen der Pinzette abziehen. Achten Sie darauf, das Mesenchym nicht zu beschädigen, da Schäden zu einem schlechten Wachstum und Ausschluss des Explantats aus einer weiteren Analyse führen können. </li><li> Übertragen Sie die Niere anlagen separat mit einer Mikroliterpipette und einer weit geöffneten Pipettenspitze in 10 μl PBS zum Polycarbonat-Membranfilter in einer 4-Well-Platte. HINWEIS: Durch die Oberflächenspannung wird das Explantat mit einer dünnen Schicht von Medium bedeckt. Ein Filter reicht für zwei Nierenanlagen aus. <ol><li> Legen Sie jedes der beiden Nieren-Anlagen in die Mitte jeder jeweiligen Hälfte des Filters. Übertragen Sie die Platte wieder auf den Inkubator bei 37 ° C / 5% CO 2 . Verlasse den Teller im Inkubator bis zum metanephrischen RudIments aus dem nächsten Embryo sind bereit, auf den Filter gelegt zu werden. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.3-2.9.1 für jeden Embryo. ANMERKUNG: Bei einigen Übungen dauert das Dissektionsverfahren etwa 5 min pro Embryo. </li><li> Inkubation der Niere anlagen für 3 Tage bei 37 ° C / 5% CO 2 . </li></ol> 3. Vorbereitung der Reagenzien zur Fixierung und Färbung <ol><li> Zur Herstellung von 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS ohne Calcium und Magnesium (w / v), löst man die PFA bei 60 ° C in PBS, kontinuierlich rühren. Auf Raumtemperatur abkühlen und mit einem Papierfilter die restlichen Partikel entfernen. Aliquot und bei 4 ° C zur sofortigen Anwendung aufbewahren oder zur Langzeitlagerung einfrieren. ACHTUNG: PFA ist giftig. Tragen Sie die persönliche Schutzausrüstung, die in den örtlichen Sicherheitsnormen angegeben ist, und arbeiten Sie in einer Abzugshaube. Verwerfung von Abfällen nach institutionellen Richtlinien und Verwendung von Abfallbehältern. </li><li> Zur Vorbereitung der Permeabilisierungslösung verdünnen Sie Triton X-100In PBS ohne Kalzium und Magnesium bis 0,3% (v / v). </li><li> Zur Herstellung der Blockierungslösung 5% (v / v) Ziegenserum und 0,1% Triton X-100 zu PBS ohne Calcium und Magnesium zugeben. Füge Natriumazid zu einer Endkonzentration von 0,02% (w / v) hinzu. Bei 4 ° C aufbewahren. ACHTUNG: Natriumazid ist giftig. Behandeln Sie Natriumazid gemäß den örtlichen Sicherheits- und Umweltschutzbestimmungen. HINWEIS: Bei der Verwendung von Antikörpern für die Färbung, verwenden Sie 5% Serum aus der Spezies der sekundäre Antikörper wurde abgeleitet, um Sperrlösung zu machen. </li><li> Verdünnen Sie biotinyliertes Dolichorus biflorus Agglutinin 1: 200 in Blockierungslösung. Verdünnen Sie Alexa488-konjugiertes Streptavidin 1: 200 in Blockierungslösung. </li><li> Zur Herstellung von gebrauchsfertigem Einbettungsmedium (siehe Tabelle der Materialien) werden 0,1 g wasserlösliches Polyvinylalkohol-basiertes Mukoadhäsiv / ml bis 25% (w / v) Glycerin in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5) . Unter ständigem Rühren für 1 h auf 50 ° C erhitzen, abkühlen lassen und den pH-Wert auf 8,0-8,5 einstellenM NaOH. Vermeiden Sie höhere NaOH-Konzentrationen. Füge 100 μg / ml N-Propylgallat und Thimerosal zu einer Endkonzentration von 0,02% (w / v) hinzu. 30 min bei Raumtemperatur umrühren. ACHTUNG: Thimerosal ist giftig. Behandeln Sie es gemäß den örtlichen Sicherheits- und Umweltschutzbestimmungen. <ol><li> Füllen Sie das Einbettungsmedium in 50 ml Röhrchen, balancieren Sie den Rotor und zentrifugieren Sie bei 3.200 xg und Raumtemperatur für 10 min. Die klare Lösung in 15 ml Röhrchen dekantieren und das Pellet entsorgen. Aliquot und bei -20 ° C für mehrere Wochen aufbewahren. Einmal aufgetaut, halten Sie die Lösung bei 4 ° C. Warm bis ~ 30 ° C sofort vor Gebrauch. </li></ol></li><li> Bereiten Sie so viele Glasrutschen vor, wie Filter mit Explantaten montiert werden sollen. Dazu kleben Sie zwei kleine Deckgläser, 18 x 18 mm, auf beiden Seiten des Glasschiebers mit Instant-Klebstoff, lassen Sie einen Durchmesser von 15 mm für den Filter dazwischen. </li></ol> 4. Fixierung und Färbung <ol><li> Nach einer Kultivierungszeit von 3Tage in vitro (div), entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und sorgfältig aspirieren das Kulturmedium aus jeder Vertiefung mit einer Mikropipette. Achten Sie darauf, den Filter nicht zu berühren und halten Sie die Spitze in Richtung der Wand des Brunnens. </li><li> Fügen Sie 500 μl 4% PFA / PBS zu jeder Vertiefung hinzu. Die Filter schweben auf dem Fixiermittel. Verwenden Sie eine Mikropipette, fügen Sie vorsichtig das PFA-Fixiermittel hinzu, um die Filter zu tauchen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min. HINWEIS: Für alle folgenden Schritte ist darauf zu achten, dass die Explantate nicht aus dem Filter abgewaschen werden. Halten Sie das Öffnen der Pipettenspitze zur Wand des Brunnens. </li><li> Entfernen Sie die PFA und spülen Sie zweimal mit 500 μl PBS, tauchen Sie den Filter ein. Füge 500 μl Permeabilisierungslösung zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiere bei Raumtemperatur für 1 h. </li><li> Spülen Sie zweimal mit 500 &amp; mgr; l PBS und fügen Sie 500 &amp; mgr; l Blockierungslösung zu jeder Vertiefung hinzu. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 h. </li><li> Ersetzen Sie die Sperrlösung durch250 μl biotinyliertes Dolichorus biflorus Agglutinin verdünnt 1: 200 in Blockierungslösung und inkubieren bei 4 ° C für 24 h. </li><li> Die Dolichorus biflorus Agglutininlösung entfernen und zweimal mit 500 μl PBS pro Vertiefung ausspülen. </li><li> Füge 250 μl Alexa488-konjugiertes Streptavidin hinzu, verdünnt 1: 200 in Blockierungslösung und inkubiere bei 4 ° C für 24 h. Alternativ bei Raumtemperatur für 2 h inkubieren. HINWEIS: Ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis wird erreicht, wenn es bei 4 ° C inkubiert wird. </li><li> Spülen Sie zweimal mit 500 μl PBS pro Vertiefung. Mit Pinzette, die Filter auf die vorbereiteten Glasrutschen übertragen, mit den Explantaten nach oben. Montage mit ~ 50-100 μl Einbettmedium. Deckel mit 60 mm langen Nr. 1,5 Deckgläschen. Man läßt die Einbettmediumlösung 2 h bei Raumtemperatur im Dunkeln erstarren. Gehen Sie zum Abbilden oder lagern Sie die Folien, in Folie verpackt, bei 4 ° C bis zum Bild. </li><li> Bild mit einem Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskop 7 &lt;/ Sup&gt; gekoppelt an eine Hg-Lampe und verwenden eine Spiegeleinheit für die blaue Anregung (Anregungsbandpass, 460 - 495 nm, dichromatischer Spiegel, 505 nm und Emissionsbandpass, 510 - 550 nm) und 20X Plan-Apochromat-Linsen, 0,75 numerisch Öffnung. </li></ol>

<ol>
	<li>Sax&#233;n, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, (1987).</li><li>Lindstr&#246;m, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+&#946;-catenin,+BMP,+PTEN,+and+Notch+signalling+patterns+the+nephron.">Integrated &#946;-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron.</a> eLife. 4, e04000 (2015).</li><li>Peuckert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+Eph/Ephrin+signaling+controls+several+phases+of+urogenital+development.">Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development.</a> Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).</li><li>Pasquale, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+receptor+signalling+casts+a+wide+net+on+cell+behaviour.">Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).</li><li>Bonanomi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ret+Is+a+Multifunctional+Coreceptor+that+Integrates+Diffusible-+and+Contact-Axon+Guidance+Signals.">Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals.</a> Cell. 148 (2), 568-582 (2012).</li><li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Cells+from+the+Nephrogenic+Zone+of+the+Embryonic+Mouse+Kidney.">Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney.</a> J Vis Exp. (50), e2555 (2011).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inductive+interaction+in+the+development+of+the+mouse+metanephros.">Inductive interaction in the development of the mouse metanephros.</a> J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).</li><li>Sax&#233;n, L., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primary Embryonic Induction. , (1962).</li><li>Sax&#233;n, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+kidney+mesenchyme+in+an+experimental+model+system.">Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system.</a> Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).</li><li>Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+FGF+and+BMP+signaling+pathways+regulates+development+of+metanephric+mesenchyme.">Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme.</a> Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).</li><li>Per&#228;l&#228;, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sema4C-Plexin+B2+signalling+modulates+ureteric+branching+in+developing+kidney.">Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney.</a> Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).</li><li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis,+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney.">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).</li><li>Watanabe, T., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+ureteric+bud+branching+morphogenesis.">Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 271, 98-108 (2004).</li><li>Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel,+Low-Volume+Method+for+Organ+Culture+of+Embryonic+Kidneys+That+Allows+Development+of+Cortico-Medullary+Anatomical+Organization.">A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization.</a> PLoS One. 5 (5), e10550 (2010).</li><li>Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlstr&#246;m, T., Dawnay, A., Sax&#233;n, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+segregation+of+the+metanephric+nephron.">In vitro segregation of the metanephric nephron.</a> Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).</li><li>Davies, J. A., Unbekandt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA-mediated+RNA+interference+in+embryonic+kidney+organ+culture.">siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture.</a> Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).</li><li>Sax&#233;n, L., Lehtonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+kidney+in+organ+culture.">Embryonic kidney in organ culture.</a> Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).</li><li>Bard, J. B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+mouse+kidney+embryogenesis+writ+small.">The development of the mouse kidney embryogenesis writ small.</a> Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).</li><li>Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cold+storage+and+transport+of+viable+embryonic+kidney+rudiments.">A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments.</a> Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).</li><li>Batourina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distal+ureter+morphogenesis+depends+on+epithelial+cell+remodeling+mediated+by+vitamin+A+and+Ret.">Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret.</a> Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode, um das sich entwickelnde metanephrische Anlagen aus dem Maus-Embryo zu isolieren und die Orgel-Rudimente zu kultivieren. Diese Methode ist eine Standardtechnik, wie sie von Grobstein 8 und Saxén 9 , 10 entwickelt wurde und von vielen anderen 11 , 12 angepasst und modifiziert wurde. Der Erfolg der Methode hängt hauptsächlich von der Dau...

The mammalian kidney is derived from two primordial structures with mesodermal origin: the tubular epithelial ureteric bud and the metanephric mesenchyme. During nephrogenesis, the ureteric bud invades the metanephric mesenchyme and branches to form the collecting system. The metanephric mesenchyme gives rise to the epithelial elements of the nephrons. These processes occur in a precisely timed and spatially coordinated manner and are initiated by reciprocal inductive mechanisms. Both tissue components communicate and affect the other's cell morphogenesis. 
In the 1920s, it was Boyden who performed the in vivo obstruction of the mesonephric duct in chicken, providing the first indication of inductive interactions as separated nephric blastema fail to differentiate1. At about the same time, the first successful attempts to culture chicken nephric rudiments in a hanging drop were published. Subsequently, the organ culture was developed to study tissue interactions in mammalian organogenesis. In the 1950s, Grobstein developed a technique in which metanephric rudiments could be cultured on a filter. This technique was modified by Sax&#233;n, who placed the filter on a Trowell-type screen in a culture dish1. Over the years, many modifications and applications for organ culture have emerged. The method described here is based on Sax&#233;n's technique but is simplified, as the filters float free on the medium and the diameter of the culture well only slightly exceeds the diameter of the filter, limiting unwanted movement of the filter.
Whole-organ culture is a classical, cheap, and simple but powerful tool to investigate cellular processes and intercellular communication during organogenesis. Organ culture allows for treatment with biological agents, such as growth factors, antibodies, antisense oligonucleotides, viruses, and peptides, as well as with pharmaceutical compounds and other chemicals. Also, gene function may be studied using explants derived from genetically modified mice or using inducible gene inactivation technology, such as the Cre-loxP system. This allows for the study of genetic mutations that cause embryonic lethality prior to the development of the kidney. Organ culture can also be combined with fluorescent tagging for gene function or lineage tracing and modern imaging techniques, which enable real-time monitoring of cell behavior2.
In the specific example provided here, the effect of EphrinB2-activated Eph-receptor signaling on the branching morphology of the ureteric bud was investigated. The morphology of the EphA4/EphB2 double-knockout mice suggested several severe defects in kidney development, which were detectable as early as embryonic day 11 (E11) and involved the ureteric bud, the ureter, and the common nephric duct3. Signaling via Eph receptors requires the clustering of the ligand-receptor dimer4. To over-activate Eph signaling, the kidney rudiments from E11.5 mouse embryos were cultured in the presence of clustered recombinant EphrinB2-Fc. EphrinB2 is a known ligand for the EphA4 receptor, which is expressed in the ureteric bud tips3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21331020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040117</td>
			<td>use for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>holo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimerosal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propyl gallate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>2370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 conjugated Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>016-540-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>496-EB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IgG1 Fc, CF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>110-HG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Human IgG Fc Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>G-102-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>use for fixation and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5, biologie 
			tips, INOX, 11cm</td>
			<td>agnthos.se</td>
			<td>0208-5-PS</td>
			<td>2 pairs of forceps are needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, straight, 12cm</td>
			<td>agnthos.se</td>
			<td>03-320-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps, 
			straight, delicate, 13cm</td>
			<td>agnthos.se</td>
			<td>08-032-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes Nunclo Delta treated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 &#181;m, 13 mm, white, plain</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>TMTP01300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Multidishes 
			4 wells, flat bottom</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6789-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass24x50mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005mm</td>
			<td>nordicbiolabs</td>
			<td>107222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses No.1.5, 18x18mm</td>
			<td>nordicbiolabs</td>
			<td>102032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides ~76x26x1, 1/2-w. ground plain</td>
			<td>nordicbiolabs</td>
			<td>1030418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA1213125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed stage research mircoscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX61WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>B6-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>B6-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greenough Stereo Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica S6 E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and culture of mouse embryonic kidney

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode für die Sektion, Isolierung und Kultur der Maus metanephrischen Rudimente zu beschreiben. Während der Säugetier-Nieren-Entwicklung, die beiden Vorläufer-Gewebe, die ureterische Knospe und das metanephrische Mesenchym, kommunizieren und wechselseitig zelluläre Mechanismen induzieren, um schließlich das Sammelsystem und die Nephrone der Niere zu bilden. Da Säugetier-Embryonen intrauterin wachsen und daher für den Beobachter unzugänglich sind, wurde eine Orgelkultur entwickelt. Mit dieser Methode ist es möglich, epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen und zelluläres Verhalten während der Nierenorganogenese zu untersuchen. Darüber hinaus kann der Ursprung von angeborenen Nieren- und Urogenitaltrakt-Fehlbildungen untersucht werden. Nach sorgfältiger Dissektion werden die metanephrischen Rudimente auf einen Filter übertragen, der auf Kulturmedium schwimmt und in einem Zellkulturinkubator für mehrere Tage gehalten werden kann. Allerdings muss man sich bewusst sein, dass die Bedingungen sindKünstlich und könnte den Stoffwechsel im Gewebe beeinflussen. Auch konnte das Eindringen von Testsubstanzen aufgrund der extrazellulären Matrix und der im Explantat vorhandenen Basalmembran begrenzt werden. Ein wesentlicher Vorteil der Orgelkultur ist, dass der Experimentator direkten Zugang zum Orgel haben kann. Diese Technologie ist billig, einfach und erlaubt eine Vielzahl von Modifikationen, wie die Zugabe von biologisch aktiven Substanzen, die Untersuchung von genetischen Varianten und die Anwendung fortschrittlicher bildgebender Verfahren.

Metanephrische Nierenanlagen wurden von schwangeren Black-6-Inzuchtmäusen bei E11.5 abgeleitet und wurden kultiviert. Nach 3 Tagen hatte sich die Harnröhre bis zu 5 Mal verzweigt, was zu einer Verzweigung der anfänglich T-förmigen Harnröhre führte. Jedes Explantat wurde fotografiert, und die Anzahl der Segmente und Endpunkte wurde quantifiziert, um die Verzweigungsgenerationen zu bestimmen und die Anzahl der Endpunkte pro Zweig zu berechnen (Abbildung 1 ). Die Erze...

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Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von metanephrischen Rudimente aus Mäuseembryonen.

Dissektion und Kultur der Maus Embryonale Niere

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.8K Aufrufe.  Uppsala University.  Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von metanephrischen Rudimente aus Mäuseembryonen. 

Serie: Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

Großzebrafisch Embryonale Herz Dissection für Transkriptionsanalyse

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transkriptom Profilieren<em&gt; In-Vivo</em&gt; Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

Kultur von murinen embryonalen Mittelfuß: ein physiologisches Modell der enchondralen Verknöcherung

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate embryonic origins and functions &#8212; the neurohypophysis and the adenohypophysis. The developing mouse pituitary gland is tiny and delicate with an elongated oval shape. A coronal section is preferred to display both the adenohypophysis and neurohypophysis in a single slice of the mouse pituitary.
The goal of this protocol is to achieve proper pituitary coronal sections with well-preserved tissue architectures from developing mice. In this protocol, we describe in detail how to dissect and process pituitary glands properly from developing mice. First, mice are fixed by transcardial perfusion of formaldehyde prior to dissection. Then three different dissecting techniques are applied to obtain intact pituitary glands depending on the age of mice. For fetal mice aged embryonic days (E) 17.5 - 18.5 and neonates up to 4 days, the entire sella regions including the sphenoid bone, gland, and trigeminal nerves are dissected. For pups aged postnatal days (P) 5 - 14, the pituitary glands connected with trigeminal nerves are dissected as a whole. For mice over 3 weeks old, the pituitary glands are carefully dissected free from the surrounding tissues. We also display how to embed the pituitary glands in a proper orientation by using the surrounding tissues as landmarks to obtain satisfying coronal sections. These methods are useful in analyzing histological and developmental features of pituitary glands in developing mice.

We present a protocol to dissect pituitary glands and prepare pituitary coronal sections from developing mice.

Dissektion und koronale Slice Vorbereitung Maus Hypophyse zu entwickeln

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Organotypischen Kultur-Methode, die Entwicklung der embryonalen Gewebe zu studieren

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...