Name: preparation of chitosan-based injectable hydrogels and its application in 3d cell culture
Uploaded: 2017-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
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Diese Forschung wurde von der National Science Foundation of China (21474057 und 21604076) unterstützt.

Vorsicht: konsultieren Sie bitte alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (SDB) vor dem Gebrauch. Bitte verwenden Sie geeignete Sicherheitsmaßnahmen beim Chemie-Experimente, einschließlich der Verwendung einer Dampfhaube und persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Schutzhandschuhe, Laborkittel, etc.) durchführen. Das Protokoll erfordert Standardzelle Umgang mit Techniken (Sterilisation, Zelle Erholung, Zelle Passagierung, Zelle Einfrieren, Zelle Färbung, etc.).
 1. Vorbereitung der Hydrogele <ol><li><ol><li>vor Austrocknung der PEG Synthese von Benzaldehyd beendet di funktionalisiert Polyethylenglykol (PEG DF) Polymer <ol><li>wiegen 4,00 g PEG (4.000 MW, 1,00 Mmol), übertragen sie in ein Rundboden-Flasche (250 mL), und fügen Sie Toluol (100 mL). 
			Hinweis: Andere Heringe mit Molekülmassen können für die Hydrogel-Bildung arbeiten aber führt zu unterschiedlicher Steifigkeit.</li>
			<li>Heizen die Lösung mit einer Heißluftpistole (oder einer heißen Platte ca. 40 ° C) mild, die Polymere lösen zu helfen. Nachdem alle Polymere zu lösen, verwenden Sie einen Verdampfer, um die Lösungsmittel zu entfernen. Wiederholen Sie diese auflösen und Trockenverfahren zweimal um die getrockneten PEG Polymere,. 
			Achtung: Dies sollte in einer Abzugshaube mit äußerster Vorsicht durchgeführt werden. Toluol ist brennbar.</li>
		</ol></li> <li>Benzaldehyd Kündigung Reaktion von PEG <ol><li>fügen Sie ein Magnetrührer und Tetrahydrofuran (THF, 100 mL) in den Kolben und PEG mit einem Rührer zu lösen. 4-Carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6,0 Mmol) und hinzufügen 4-Dimethylaminopyridine (0,07 g, 0,6 Mmol) nacheinander die Lösungen für alle Körper vollständig aufzulösen.</li>
			<li>Add N, N &#39;-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6,0 Mmol) zur Lösung, und fügen Sie eine Trocknung Rohr, das wasserfreie CaCl 2 bis die Flasche voll ist. Halten Sie die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur (~ 20 ° C) für ca. 12 Std.</li>
		</ol></li> <li>Post-Reaktionsvorgangs <ol><li>herausfiltern der weißen Feststoff in die Lösung durch ein Vakuum erzeugt, nachdem die Reaktion beendet ist. Gießen Sie die Lösung in kalten Diethylether (500 mL) unter Rühren zu der weißen Feststoff ausgefällt. Die weißen Feststoffe durch Filter sammeln und Trocknen der Feststoffe in einer Dampfhaube.</li>
			<li>Der weißen Feststoff in THF wieder auflösen, unlöslichen weißen Feststoff herausfiltern, Gießen Sie die Lösung in frischem kalten Diethylether der weißen Feststoff ausgefällt und trocknen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei-bis dreimal, und legen Sie dann den weißen Feststoff in eine Vakuumtrocknung Ofen (20 ° C, 0,1 Mbar), um sie vollständig zu trocknen. Das weiße Pulver wie das fertige Produkt zu sammeln: Benzaldehyd beendet DF PEG.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Vorbereitung der Hydrogele <ol><li>wiegen unterschiedliche Mengen an DF PEG (0,11 g, 0,028 Mmol 0,22 g, 0,055 Mmol; 0,44 g, 0.110 Mmol) in einem Rohr (10 mL), deionisiertes Wasser (5,0 mL) hinzufügen und verwenden ein Wirbel oder Magnetrührer Das Polymer auflösen.</li>
		<li>Glykol Chitosan (0,495 g, 6,18 x 10 -3 Mmol) in entionisiertem Wasser (15,0 mL) in einem Rohr (50 mL) auflösen und einen Strudel für ein paar Minuten zu verwenden, um die Chitosan-Lösung (3 Gew.-%) homogenisieren.</li>
		<li>Glykol-Chitosan-Lösung (0,2 mL, 3 Gew.-%) und DF PEG Lösungen (0,2 mL) nacheinander in einer Röhre (2,0 mL) dazugeben. Verwenden Sie einen Wirbel um die Lösungen homogen zu Form Hydrogele in einigen Minuten mischen. Befolgen Sie die Verhältnisse in Tabelle 1 Hydrogele der unterschiedlichen Festigkeiten machen. 
		Hinweis: Verwenden Sie die Röhre invertierenden Methode um festzustellen, ob das Hydrogel schon gebildet hat.</li>
	</ol></li> <li>Rheologie Analysen <ol><li>Rheologie Analysen auf eine rotierende Rheometer mit einer parallelen Stahlplatte durchführen (Durchmesser: 20 mm). Verteilen Sie für die Gelierung Test Glykol-Chitosan-Lösung (0,2 mL, 3 Gew.-%) auf eine untere Platte. Dann fügen Sie DF PEG wässrige Lösungen (0,2 mL, 2 Gew.-%) gleichmäßig tropfenweise auf die Chitosan-Lösung-Oberfläche und mischen mit einer Pipette schnell. Tiefer unten die obere Platte und beginnen zu Test</li>
		<li>Für Hydrogel &#39; s Steifigkeit Test, schneiden ein Hydrogel in einem Kreis (Durchmesser: 20 mm) und Messen Sie die Speicher-Modul (G &#39;) Werte im Vergleich zu Frequenzanalysen bei 1 % Dehnung. Typische G &#39; Werte bei 6,3 rad s &#8722; 1 in Tabelle 1 aufgeführt sind. 
		Hinweis: Analysen durchführen, die Rheologie Hydrogel 0,5 h nach der Hydrogel-Bildung um dynamische Bindung Stabilisierung der Hydrogel sicherzustellen.</li>
		<li>Für das Hydrogel &#39; s selbst heilbar-Eigenschaft zu testen, ein Hydrogel in Stücke schneiden und die Stücke zu heilen, ein integraler Teil versammeln. Dann schneiden Sie das Hydrogel Stück zu einem Kreis (Durchmesser: 20 mm) und legen Sie es auf dem Rheometer, die Rheologie-Analyse durchführen.</li>
	</ol></li></ol> 2. 3D Zellkultivierung in Hydrogele <ol><li>Herstellung von Hydrogel Gelierung Lösungen <ol><li>wiegen DF PEG (0,44 g, 0,11 Mmol) in ein steriles Röhrchen (4,0 mL), in Zellkulturmedien (RPMI-1640, 2.0 hinzufügen (mL), und verwenden ein Wirbel oder Rührer Auflösen des Polymers um die Polymerlösung (20 Gew.-%) zu erhalten. Laden Sie die Projektmappe in einer Spritze (10,0 mL) und dann indem man es durch einen Bakterien-remanent Mikron-Filter (0,22 µm) zu sterilisieren.</li>
		<li>Wiegen der Glykol-Chitosan (0,165 g, 2,06 x 10 -3 Mmol) in ein steriles Röhrchen (15,0 mL), fügen Sie in Zellkulturmedien (RPMI-1640, 4,0 mL) und Wirbel zu helfen, das Polymer zu Glykol-Chitosan-Lösung (4,0 Gew.-%) auflösen. Laden Sie die Projektmappe in einer Spritze (10,0 mL) und mit einem Bakterien remanent 0,22 µm-Filter filtern.</li>
	</ol></li> <li>Zellkultivierung in Hydrogele Vorsicht: führen Sie alle entsprechenden Verfahren in einer Gewebekultur Kapuze Zelle. Grundkenntnisse in steriler Technik wird erwartet.
	<ol><li>Vorbereitung der Zellsuspension <ol><li>Kultur L929 Zellen RPMI-1640 Medium ergänzt mit 10 % FBS, 5 % Penicillin (10 mL) in ein Petri-Schale (Durchmesser 10 cm), und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO 2. Jeden Tag vor Gebrauch das Medium wechseln.</li>
			<li>Ernten die L929 Zellen mit PBS mit Trypsin (0,025 w/V %) und EDTA (0,01 % w/V), anschließend Zentrifugieren (70 X g, 5 min) und wieder auszusetzen, die Zellen im RPMI-1640 Medium (1,0 mL). Führen Sie die Zellzählung mit standard Operation Blut zählen Board. Wieder aussetzen die Zellen, um die Zellkonzentration zu justieren ~ 3,75 × 10 6 Zellen/mL.</li>
		</ol></li> <li>Zelle Kapselung in Hydrogele <ol><li>L929 Zellsuspensionen (0,4 mL, 3,75 x 10 6 Zellen mL -1) mit Glykol-Chitosan-Lösung (0,4 mL) in einem Rohr (4,0 mL) von Vortex mischen. Pipette L929/Glykol-Chitosan-Lösung (0,8 mL) in die Mitte einer konfokalen Petrischale (Durchmesser 2,0 cm). Pipette die DF PEG-Lösung (0,2 mL) in das gleiche Gericht und pipette vorsichtig mischen Sie die Lösung zu induzieren Hydrogel Bildung. 
			Hinweis: Bewerten die Hydrogel-Bildung durch Kippen der Petrischale.</li>
			<li>Für direkte Zellkultur hinzufügen zusätzliche Mengen von RPMI-1640 Nährmedien (1,0 mL) auf das Hydrogel. Legen Sie die Zelle eingebettet Hydrogele (1,0 mL, 4,0 Gew.-% DF PEG, 1,5 Gew.-% % Glykol Chitosan 1,5 × 10 6 Zellen mL -1) in einem Inkubator (37 ° C, 5 % CO 2) und verändern Sie das Medium jeden Tag. Bereiten Sie für die Zelle Bildgebung am Tag 1, 3, 5 und 7 nach Zelle Kapselung.</li>
		</ol></li> <li>Vorbereitung der 3D Post-Zellkultur in Hydrogele nach Injektion, Zelle geladen Hydrogel (1,0 mL, siehe Punkt 2.2.2) in einer Spritze (10,0 mL, 48 G-Nadel). Nach der Hydrogel-Formen Hydrogel langsam in eine Petrischale für die konfokale Bildgebung zu injizieren. Fügen Sie einen zusätzlichen Betrag von Nährmedien (1,0 mL) auf das Hydrogel und ändern Sie es jeden Tag. Setzen der Petrischale in einem Inkubator (37 ° C, 5 % CO 2) und bereiten sich für danach imaging. 
		Achtung: Bitte überprüfen Sie und das Sicherheitsprotokoll Betrieb einer Spritze zu folgen.</li>
	</ol></li> <li>Lebensfähigkeit Zellanalyse <ol><li>konfokale Beobachtung <ol>
			<li>Spülen die Hydrogele mit PBS (1,0 mL) zwei Mal. Färben Sie die Hydrogele mit Fluorescein-Diacetat (FDA, 0,5 mL, 0,05 mg/mL) und Propidium Jodid (PI, 0,5 mL, 0,08 mg/mL) Lösungen für 15 Minuten. Nach dem Färben, entfernen Sie alle Lösungsmittel.</li>
			<li>Beobachten die Hydrogele mit einem konfokalen Mikroskop unter Erregung Wellenlängen von 488 nm und 543 nm live zu visualisieren und toten Zellen, beziehungsweise. Z-Stapel durch jeden 2 µm Tiefe der Hydrogele, eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im ganzen zu validieren zu nehmen. 
			Hinweis: FDA Flecken lebenden Zellen während PI abgestorbene Zellen Flecken.</li>
		</ol></li> <li>Degradieren Hydrogel (1,0 mL) mit Essigsäure (HAc, 3 V %, 1,0 mL) für 5 min und Pipette in ein Rohr (4,0 mL). Sammeln Sie Zellen durch Zentrifuge (70 X g, 5 min) zu und wieder auszusetzen Sie, die Zellen im Zellkulturmedium RPMI-1640 (1,0 mL). Zellzählung mit einem Blut zählen Board durchführen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+biomedical+applications.">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).</li><li>Seliktar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+cell-compatible+hydrogels+for+biomedical+applications.">Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications.</a> Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Sawicki, L. 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Today. 18 (5), 240-249 (2013).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilely+prepared+inexpensive+and+biocompatible+self-healing+hydrogel:+a+new+injectable+cell+therapy+carrier.">Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier.</a> Polym. 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Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulus-regulated+3D-cell+proliferation+in+an+injectable+self-healing+hydrogel.">Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel.</a> Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).</li><li>Tseng, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Injectable,+Self&#8208;Healing+Hydrogel+to+Repair+the+Central+Nervous+System.">An Injectable, Self&#8208;Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System.</a> Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).</li><li>Yu, L., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hydrogels+as+unique+biomedical+materials.">Injectable hydrogels as unique biomedical materials.</a> Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+Tumor+Chemotherapy+Effect+by+Using+an+Injectable+Self-healing+Hydrogel+as+Drug+Carrier.">Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier.</a> Polym. Chem. , (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+magnetic+self-healing+hydrogel.">A magnetic self-healing hydrogel.</a> Chem. 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W., Baaijens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+viscoelastic+behavior+of+subcutaneous+adipose+tissue.">Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue.</a> Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+hydrogel+modulus+on+the+proliferation+and+differentiation+of+encapsulated+neural+stem+cells.">The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells.</a> Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).</li><li>Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+functional+groups+for+controlled+differentiation+of+hydrogel-encapsulated+human+mesenchymal+stem+cells.">Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells.</a> Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Hydrogel präsentiert in diesem Protokoll (Abbildung 1) besteht aus zwei Hauptkomponenten: natürliches Polymer Glykol Chitosan und synthetischen Benzaldehyd beendet Polymer Geliermittel DF PEG, die beide biokompatible Werkstoffe sind. Synthese von DF PEG wird vorgestellt mit einer einstufigen Modifikation Reaktion. PEG Molekulargewicht 4.000 wurde dieses Protokoll in Belange der Löslichkeit, Änderung Effizienz sowie Hydrogel Steifigkeit gewählt. Eine Reihe von Hydrogele mit unterschi...

Hydrogele sind vernetzte Polymerwerkstoffe mit großen Mengen an Wasser und weichen mechanischen Eigenschaften, und sie haben in vielen Bio-medizinischen Anwendungen1,2benutzt worden. Hydrogele bieten eine weiche und feuchte Umgebung, die sehr zu den physiologischen Umgebung für Zellen in Vivo ähnlich. Hydrogele sind daher eines der beliebtesten Gerüste für 3D Zelle Kultur3,4geworden. Im Vergleich zu 2D Petrischale Zellkultur, hat 3D Zellkultur schnell avancierte um zu bieten, dass eine extrazelluläre Matrix (ECM) ahmte Mikroumgebung für Zellen zu kontaktieren und für Proliferation und Differenzierung Zwecke5montieren. Darüber hinaus könnte Hydrogele, enthält natürliche Polymere bieten ein Umfeld, biokompatibel und Förderung für Zellen zu vermehren und3unterscheiden. Hydrogele aus synthetischen Polymeren abgeleitet werden bevorzugt für ihre einfachen und klaren Komponenten, die komplexen Einflüsse wie Proteine tierischen Ursprungs oder Viren auszuschließen. Unter all den Hydrogel-Kandidaten für 3D Zellkultur werden Hydrogele, die sind einfach vorbereitet und verfügen über eine einheitliche Eigenschaft immer bevorzugt. Die Anlage der Hydrogel Eigenschaften verschiedenen Anforderungen anpassen anpassen ist wichtig wie gut6.
Hier stellen wir eine einfache Vorbereitung ein Glykol Chitosan basierenden Hydrogel mit dynamischen Imin-Chemie, die eine vielseitige Hydrogel-Plattform für 3D Zelle Kultur7wird. Bei dieser Methode bekannte biokompatible Glykol Chitosan werden verwendet, um Bilder der Hydrogel-Netzwerke zu etablieren. Die Aminogruppen werden als Polymer Geliermittel, dynamische Imin Anleihen als Crosslinkages Hydrogele8zu bilden mit einem Benzaldehyd beendet Polyethylenglykol reagiert. Dynamische Imin Anleihen können bilden und zersetzen reversibel und entgegenkommend, Umgebung, stiften die Hydrogele mit mechanisch verstellbaren querverbunden Netzwerke9,10,11. Aufgrund seiner hohen Wassergehalten, biokompatible Materialien und einstellbare mechanische Festigkeiten wird das Hydrogel als Gerüst für L929 Zellen in 3D Zelle Kultur12,13erfolgreich eingesetzt. Das Protokoll hier beschreibt die Verfahren, einschließlich der Polymersynthese Geliermittel, Hydrogel Vorbereitung Zelle einbetten und 3D Zelle zu züchten.
Das Hydrogel zeigt auch einige andere Funktionen aufgrund seiner dynamischen Imin-Crosslinkages, einschließlich seiner Multi-reagieren auf verschiedene Bio-Reize (Säure/pH, Derivative Vitamin B6 Pyridoxal, Protein Papain, etc.), darauf hinweist, dass das Hydrogel sein könnte unter physiologischen Bedingungen8zersetzen induziert. Das Hydrogel ist auch selbst heilbar und injizierbare, was bedeutet das Hydrogel könnte über eine minimal invasive Injektion Methode verwaltet werden und einen Vorteil in der Drogen- und Zelle Lieferungen14,15. Indem funktionelle Additive oder bestimmte vordefinierte Polymer Gelatoren Hydrogel ist kompatibel zur Gewinnung von spezifischen Eigenschaften wie magnetisch, Temperatur, pH-Wert reagieren, etc.16,17, die zu erfüllen, könnte ein breite Palette von Forschungsbedarf. Diese Eigenschaften zeigen das Hydrogel potentielle Fähigkeit, eine injizierbare werden mehrere Träger für Medikamente und Zellen in Vitro und in Vivo biomedizinische Forschung und Anwendungen.

<table><tbody><tr><td>Glycol chitosan</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>39280-86-9</td><td>90% degree of deacetylation</td></tr><tr><td>4-Carboxybenzaldehyde</td><td>Shanghai Aladdin&amp;nbsp;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td><td>619-66-9</td><td>99%</td></tr><tr><td>N, N&#039;-dicyclohexylcarbodiimide</td><td>Shanghai Aladdin&amp;nbsp;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td><td>538-75-0</td><td>99%</td></tr><tr><td>Calcium chloride anhydrous</td><td>Shanghai Aladdin&amp;nbsp;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td><td>10043-52-4</td><td>96%</td></tr><tr><td>4-dimethylamiopryidine</td><td>Shanghai Aladdin&amp;nbsp;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td><td>1122-58</td><td>99%</td></tr><tr><td>Polyethyleneglycol</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>5254-43-7</td><td>99%</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>109-99-9</td><td>99%</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>108-88-3</td><td>99%</td></tr><tr><td>Ethyl ether</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>60-29-7</td><td>99%</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>64-19-7</td><td>99%</td></tr><tr><td>Anhydrous CaCl2</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>10043-52-4</td><td>99%</td></tr><tr><td>Fluorescein diacetate</td><td>Sigma</td><td>596-09-8</td><td>99%</td></tr><tr><td>Propidium iodide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>25535-16-4</td><td>94%</td></tr><tr><td>RPMI-1640 culture media</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td></td><td>0.25%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td></td><td>0.01 M</td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin solution</td><td>Hyclone</td><td></td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>Rheometer</td><td>TA Instrument</td><td></td><td>AR-G2</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>710-3channel</td></tr><tr><td>L929 Cells</td><td>ATCC</td><td></td><td>NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L</td></tr><tr><td>Evaporator</td><td>EYELA</td><td></td><td>N-1100</td></tr><tr><td>48 guage needle</td><td>ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD</td><td></td><td>48-guage</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>DM3000 B</td></tr><tr><td>Microscope software</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat gun</td><td>Confu</td><td></td><td>KF-5843&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of chitosan-based injectable hydrogels and its application in 3d cell culture

Das Protokoll stellt eine einfache, effiziente und vielseitige Methode um Chitosan-basierte Hydrogele mit dynamischen Imin Chemie vorzubereiten. Das Hydrogel wird durch das Mischen von Lösungen von Glykol Chitosan mit einem synthetisierten Benzaldehyd beendet Polymer Geliermittel vorbereitet und Hydrogele werden effizient in einigen Minuten bei Raumtemperatur erhalten. Durch unterschiedliche Verhältnisse zwischen Glykol Chitosan, Polymer Geliermittel und Wassergehalten ergeben sich vielseitige Hydrogele mit verschiedenen Gelierung Zeiten und Steifigkeit. Wenn beschädigt, kann das Hydrogel seine Auftritte und e-Modul durch die Reversibilität der dynamischen Imin Anleihen als Crosslinkages wiederherstellen. Diese selbst heilbar Eigenschaft ermöglicht das Hydrogel zu injizierbaren sein, da es nach dem Spritzvorgang selbst geheilt aus gepressten Stücke zu einer integralen Bulk-Hydrogel. Das Hydrogel ist auch Multi-reagiert auf viele bioaktive Reize durch unterschiedliche Gleichgewichtherstellung Status der dynamischen Imin Anleihen. Dieses Hydrogel wurde als biokompatibel, bestätigt und L929 Maus-Fibroblasten-Zellen waren eingebettete folgende standard-Verfahren und die Zellproliferation wurde leicht durch eine 3D Zellprozess Anbau beurteilt. Hydrogel bieten eine verstellbare Plattform für verschiedene Forschung, wo eine physiologische Imitation einer 3D-Umgebung für Zellen profitiert wird. Zusammen mit seiner Multi-reagieren, selbst heilbar und injizierbaren Eigenschaften kann die Hydrogele potenziell als mehrere Träger für Medikamente und Zellen in zukünftigen biomedizinischen Anwendungen angewendet werden.

Eine schematische Darstellung dieses Protokolls auf Hydrogel Vorbereitung und seine Verwendung als 3D Zellkultur wird in Abbildung 1angeboten. Informationen der Hydrogel Inhalte und Kennzahlen mit unterschiedlichen Festigkeiten vorbereitet werden in Tabelle 1zusammengefasst. Das Hydrogel ist selbst heilbar und Rheologie-Eigenschaft stellt die Hydrogel Steifigkeit durch Speicher-Modul gegen frequenztest in Abbildung 2. Die Zelle konfokale Bilder ...

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Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

Hier beschreiben wir eine einfache Zubereitung von Chitosan-basierten injizierbaren Hydrogele mit dynamischen Imin Chemie. Methoden der Hydrogel mechanische Festigkeit und seine Anwendung in 3D Zellkultur anpassen werden vorgestellt.

Vorbereitung der Chitosan-basierten injizierbaren Hydrogele und deren Anwendung in 3D Zellkultur

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

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JoVE Journal

Chemistry

19.0K Aufrufe.  Tsinghua University. Hier beschreiben wir eine einfache Zubereitung von Chitosan-basierten injizierbaren Hydrogele mit dynamischen Imin Chemie. Methoden der Hydrogel mechanische Festigkeit und seine Anwendung in 3D Zellkultur anpassen werden vorgestellt.

Serie: Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

Einfache Handhabung von Architekturen in Protein-basierte Hydrogele für Zelle Kultur Anwendungen

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Forschung

Biochemie

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively for tissue regeneration, a number of variables must be taken into account. These variables include: the total volume and surface area of the implantation site, the mechanical properties of the tissue and the tissue microenvironment, which includes the amount of vascularization and the components of the extracellular matrix. Therefore, the materials being used to deliver these cells must be biocompatible with a defined chemical composition while maintaining a mechanical strength that mimics the host tissue. These materials must also be permeable to oxygen and nutrients to provide a favorable microenvironment for cells to attach and proliferate. Chitosan, a cationic polysaccharide with excellent biocompatibility, can be easily chemically modified and has a high affinity to bind with in vivo macromolecules4-5. Chitosan mimics the glycosaminoglycan portion of the extracellular matrix, enabling it to function as a substrate for cell adhesion, migration and proliferation. In this study we utilize chitosan in the form of microspheres to deliver adipose-derived stem cells (ASC) into a collagen based three-dimensional scaffold6. An ideal cell-to-microsphere ratio was determined with respect to incubation time and cell density to achieve maximum number of cells that could be loaded. Once ASC are seeded onto the chitosan microspheres (CSM), they are embedded in a collagen scaffold and can be maintained in culture for extended periods. In summary, this study provides a method to precisely deliver stem cells within a three dimensional biomaterial scaffold.

A major hurdle in current stem cell therapies is determining the most effective method to deliver these cells to host tissues. Here, we describe a chitosan-based delivery method that is efficient and simple in approach, while allowing adipose-derived stem cells to maintain their multipotency.

Der Bau einer Kollagen-Hydrogel für die Lieferung von Stem Cell-beladenen Chitosan-Mikrokügelchen

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Biotechnik

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) substrates such as tissue culture polystyrene (TCPS). However, characteristic changes of PDL cells have been observed during in vitro culture. This phenomenon is probably because the 2D TCPS differs from the in vivo three-dimensional (3D) microenvironment. Compared to cells cultured on 2D substrates, cells grown in a 3D microenvironment exhibit more similarities to in vivo cells. Therefore, 3D cell culture models provide a promising alternative for conventional 2D monolayer cell culture. To improve conventional PDL cell culture models, we have recently developed a 3D cell culture method, which is based on spheroid formation of PDL cells on chitosan films. Here, we present detailed cell spheroid culture protocols based on chitosan films. The 3D culture system of PDL cellular spheroids overcome some of the limitations related to conventional 2D monolayer cell culture, and thus may be suitable for producing PDL cells with an enhanced therapeutic efficacy for future periodontal tissue regeneration.

Here, we present protocols of culturing human periodontal ligament (PDL) cell spheroids by chitosan films. The culture of three-dimensional (3D) cellular spheroids provides an alternative to conventional tissue culture polystyrene (TCPS) culture system.

Bildung von Human Periodontal ligament Cell Spheroids auf Chitosan Filmen

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...

Entwicklungsbiologie

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Kultivierung von Säugerzellen in dreidimensionale Peptid Gerüste

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, chitosan microgels are commonly fabricated using emulsion methods that require organic solvent rinses, which are toxic and harmful to the environment. The present protocol presents a rapid, non-cytotoxic, non-emulsion-based method for fabricating chitosan-genipin microgels without the need for organic solvent rinses. The microgels described herein can be fabricated with precise size control. They exhibit sustained release of biomolecules, making them highly relevant for tissue engineering, biomaterials, and regenerative medicine. Chitosan is crosslinked with genipin to form a hydrogel network, then passed through a syringe filter to produce the microgels. The microgels can be filtered to create a range of sizes, and they show pH-dependent swelling and degrade over time enzymatically. These microgels have been employed in a rat growth plate injury model and were demonstrated to promote increased cartilage tissue repair and to show complete degradation at 28 days in vivo. Due to their low cost, high convenience, and ease of fabrication with cytocompatible materials, these chitosan microgels present an exciting and unique technology in tissue engineering.

The present protocol describes a non-emulsion-based method for the fabrication of chitosan-genipin microgels. The size of these microgels can be precisely controlled, and they can display pH-dependent swelling, degrade in vivo,&#160;and be loaded with therapeutic molecules that release over time in a sustained manner, making them highly relevant for tissue engineering applications.

Herstellung von größenkontrollierten und emulsionsfreien Chitosan-Genipin-Mikrogelen für Tissue-Engineering-Anwendungen

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, ...