Diese Arbeit wurde unterstützt von der American Heart Association [Beihilfe 0365274B H.L], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964, Z.W.], National Institutes of Health [Büro der Forschung Infrastruktur gemeinsam Instrumentierung Grant S10RR031845, die Lichtmikroskopie Imaging-Anlage an der Case Western Reserve University], und China Scholarship Council [zu X.G.]. Die Autoren danken Richard Lee in Light Microscopy Imaging Core für seine Hilfe mit Dia scannen.

Alle hier beschriebenen Experimente, bei denen Mäuse wurden von der Case Western Reserve University institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt. Der Titel des Protokolls 2016-0068 (PI: Hua Lou) ist "Role of alternative Pre-mRNA Spleißen in vertebrate Entwicklung".
Hinweis: Informationen aller Ausrüstung, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien, die in diesem Protokoll verwendeten sind in Tabelle der Materialienenthalten.
1. bereiten Sie Formalin feste Paraffin eingebettet (FFPE) Abschnitte
<ol><li>
1 CD1-Maus und 1 C57BL/6J Maus durch zervikale Dislokation einschläfern. Schneiden Sie vorsichtig auf, den Schädel mit chirurgische Scheren und Pinzetten. Das Gehirn mit einer Schaufel zu entfernen. Hinweis: 5-Monate-alten CD1 männliche Mäuse und 3-Monate-alten C57BL/6J männliche Mäuse wurden eingesetzt und zeigten ähnliche Ergebnisse.<ol>
<li>Waschen Sie das Gehirn mit PBS. Befestigen Sie das ganze Gehirn mit einer Lösung, die 10 % Formalin bei Raumtemperatur (RT) für 30 h indem man das ganze Gehirn in 50 mL Formalin-Lösung.</li>
		<li>Ändern Sie die festlegunglösung auf PBS und inkubieren das Gehirn mit PBS-Puffer über Nacht bei 4 ° c Entwässern und das Gehirn mit Xylol und Paraffin mit Standardverfahren18einbetten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verwenden Sie ein Mikrotom, um eingebettete Gewebe 5 µm Ablängen. Setzen Sie das Paraffin-Band in eine RT-Wasserbad, zuerst, und dann im Wasserbad 45 ° C, die Multifunktionsleiste zu verbreiten.
	<ol>
<li>Wenn die Runzeln und Falten in der Multifunktionsleiste verschwinden, sofort montieren Sie Abschnitte auf Glasobjektträger. Luft trockenere Folien über Nacht bei RT Bake Folien für 1 h bei 60 ° C vor dem Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Beispiel-Vorbehandlung
<ol><li>
Deparaffinize Gewebeschnitten. Führen Sie diese Schritte in einer Dampfhaube.
	<ol>
<li>Füllen Sie zwei abwaschen (Abbildung 1A) mit 250 mL frischem Xylol und zwei mit 250 mL 100 % Ethanol. Einfügen von Gewebe Folien in einer waschen Rack (Abbildung 1A) und das Waschen rack in abwaschen, die nach der Bestellung und Inkubation Zeit in Tabelle 1angegeben.</li>
		<li>Während jeder Inkubation heben Sie waschen Rack rauf und runter mehr als 3 Mal in der Wasch-Schale. Nach jeder Inkubation bewegen sich schnell waschen Rack in die nächsten waschen Schüssel die Gewebeschnitte vor dem Austrocknen zu verhindern.</li>
		<li>Entfernen Sie nach Abschluss der inkubationsschritte waschen Rack mit Folien aus der Schale waschen. Platzieren Sie die Zahnstange in einem Inkubator von 60 ° C für 5 Minuten oder bis die Folien vollständig trocken sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zeichnen Sie eine 0,75 '' x 0,75 '' Barriere rund um den Gewebe-Abschnitt mit einem Stift hydrophobe Barriere. Luft trocknen die Barriere für 3 min bei RT</li>
	<li>
Vorbehandeln Scheiben
	<ol>
<li>Reagenzien und Geräte vorbereiten<ol>
<li>Einschalten der Hybridisierung Ofen (Abbildung 1 b) und Temperatur auf 40 ° C 30 min vor Gebrauch.</li>
			<li>Die befeuchtenden Papier (Abbildung 1E) mit destilliertem Wasser komplett nass und steckte es in Feuchtigkeit Kontrolle Tablett (Abbildung 1, Links). Halten Sie Feuchtigkeit Kontrolle Fach in der Hybridisierung-Ofen.</li>
			<li>Bereiten Sie 700 mL frische 1 X Target Retrieval Reagenzien durch Zugabe von 630 mL dH2O bis 70 mL 10 X Target Retrieval Reagenzien vor.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Anwendung von Wasserstoffperoxid.<ol>
<li>Setzen Sie die deparaffinized Rutschen auf der Bank. Fügen Sie 5 – 8 Tropfen Wasserstoffperoxid zu einem Abschnitt auf das Gewebe vollständig zu bedecken. 10 min bei RT inkubieren</li>
			<li>Tippen Sie auf die Folien auf einem Stück Küchenpapier, Wasserstoffperoxid-Lösung, eine Folie zu einem Zeitpunkt zu entfernen. Sofort legen Sie die Folie einbauen möchten waschen und nach ein waschen Schale gefüllt mit dH2O. rack</li>
			<li>Waschen Sie die Folien durch Verschieben der Zahnstange rauf und runter in destilliertem Wasser für 3 – 5 Mal. Ein waschen Schale gefüllt mit frischem destilliertem Wasser und waschen Folien noch einmal waschen Rack ans.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Führen Sie Ziel abrufen<ol>
<li>Legen Sie eine 1.000 mL-Becherglas auf einer heißen Platte. Fügen Sie 700 mL frische 1 X Target Retrieval Reagenzien in das Becherglas und mit Folie abdecken. Legen Sie einen Thermometer in den Becher durch die Folienabdeckung (Abbildung 1). Schalten Sie die Heizplatte und hoch für 10 – 15 Minuten angesetzt.</li>
			<li>Wenn die Temperatur der Abruf Reagenzien 98 ° C erreicht hat, wechseln Sie die Temperaturregelung der Heizplatte von hoch zu niedrig um milde Kochen zu halten. Nicht kochen Sie mehr als 15 min.</li>
			<li>Unterdessen sorgfältig öffnen Sie die Folie und legen Sie das Waschen Rack mit Scheiben im Inneren der Abruf Regent. Das Becherglas wieder abdecken und 15 min inkubieren.</li>
			<li>Verwendung Zange Rack aus den Becher auf einen Teller waschen entfernen gefüllt mit 200 mL dH2O und spülen für 15 s.</li>
			<li>Verschieben der Zahnstange in eine Wasch-Schale mit 100 % frischem Ethanol und für 3 min. Folien entfernen und trocknen Sie sie in einem 60 ° C Inkubator für 10 min. stehen lassen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Protease III gelten<ol>
<li>Legen Sie die Folien auf den Fleck Rost (Abbildung 1, rechts). Tropfen Sie 5 Protease III um das Gewebe zu decken. Vorsichtig legen Sie die Zahnstange in die Luftfeuchtigkeit Kontrolle Schublade (Abbildung 1, Links) und setzen Sie die Schale in den Ofen 40 ° C Hybridisierung. 30 min inkubieren.</li>
			<li>Entfernen Sie die Folie Rack und stellte das Tablett wieder in den Ofen. Tippen Sie auf die Folien, um die überschüssige Flüssigkeit, eine Folie zu einem Zeitpunkt zu entfernen. Legen Sie die Folie in einem waschen Rack und Ort das Rack in einem waschen Schale voller dH2O. Move Rack rauf und runter, um die Folien für Waschen 3-5 Mal.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) ISH Assay
<ol><li>
Bereiten Sie Materialien
	<ol>
<li>Wärmen Sie 50 x Waschpuffer in einem Inkubator 40 ° C für 20 min. Mix 2,94 L dH2O und 60 mL 50 x Waschpuffer, 1 x Waschpuffer zu machen vor.</li>
		<li>Bereiten Sie 50 % Hämatoxylin Färbelösung durch Zugabe von 100 mL Gills Hämatoxylin ich bis 100 mL dH2O. Prepare 0,02 % (w/V) Ammoniak Wasser durch Zugabe von 1,43 mL 1 N Ammonium Hydroxid, 250 mL von dH2O. Mix in einem Behälter gut vor.</li>
		<li>Setzen Sie die Sonden und AMP 0 – 6 Reagenzien bei RT 30 min vor Gebrauch. Halten Sie die Luftfeuchtigkeit Kontrolle Fach im 40 ° C Hybridisierung Ofen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ISH-Verfahren Hinweis: Um die Expression von Nf1 Spleißen Isoformen prüfen und berechnen die Prozent (PSI) Wert für Exon 23a, drei verschiedene ISH-Sonden, die auf Exon 23a enthalten Isoform gespleißt sind, Exon 23a ausgeschlossen Isoform oder beide Isoformen verwendet (Abbildung 2 ). Die Sonden werden benachbart geschnittenen Gewebeschnitte verwendet. Um die Genauigkeit der Berechnung zu gewährleisten, ist es wichtig, dass die drei Gewebeschnitte behandelt werden genauso in der Hybridisierung, Verstärkung und Signal-Erkennung-Schritten.<ol>
<li>Sonde Hybridisierung.<ol>
<li>Entfernen Sie die Folien aus dem Waschen Rack und tippen Sie auf die überschüssige Flüssigkeit aus den Folien. Legen Sie die Folien in der Fleck-Rack.</li>
			<li>Benutzen Sie einen Bleistift, um die Folien mit der Sonde Namen zu beschriften. Setzen Sie die drei benachbart geschnittene Gehirn Gewebe Folien zusammen mit drei verschiedenen Nf1 Sonden (Abbildung 2) hybridisiert werden. Führen Sie die nachfolgenden Schritte in der gleichen Reihenfolge von Folien.</li>
			<li>4 Tropfen der Sonde um das Gewebe zu decken. Tun Sie diese eine Folie zu einem Zeitpunkt zu die Abschnitten Austrocknen verhindert wird. Legen Sie die Fleck-Rack in der Feuchtigkeit Kontrolle Fach und fügen Sie es in den 40 ° C Backofen für 2 h.</li>
			<li>Waschen Sie die Objektträger zweimal mit Waschpuffer. Füllen Sie für jedes waschen die Färbung Schüssel mit 200 mL 1 x Waschpuffer und platzieren Sie Regales waschen drin. Tippen Sie auf überschüssige Flüssigkeit auf ein Papier Handtuch eine Folie gleichzeitig und einfügen Sie schnell waschen Rack. Bewegen der Folie Rack rauf und runter in die Schüssel für 3 – 5 Mal für 2 min bei RT</li>
			<li>Verwenden Sie für die zweite Wäsche frisch Waschpuffer.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Signalverstärkung.<ol>
<li>Tippen Sie auf die überschüssigen Waschpuffer von Folien und legen Sie sie in das Fleck-Rack. Tropfen Sie 4 AMP 0 um das Gewebe zu decken. Legen Sie die Fleck-Rack in der Feuchtigkeit Kontrolle Fach und legen Sie sie in den Ofen für 30 min. bei 40 ° C.</li>
			<li>Waschen Sie die Folien zweimal mit Waschpuffer wie oben beschrieben.</li>
			<li>Wiederholen Sie diesen Schritt mit AMP 1 – 6 Anschluss an die Bestellung und den Zustand der Tabelle 2. Waschen Sie die Folien zweimal nach jedem Schritt Hybridisierung.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Signalerkennung<ol>
<li>Tippen Sie auf die überschüssigen Waschpuffer von den Folien und legen Sie sie in Fleck Rack. Fast Red 120 µL 2 µL schnell rot B hinzufügen (Verhältnis 1: 60) in einem Microcentrifuge Schlauch. Mischen Sie gut und um Abschnitt Gewebe vollständig zu decken. Hinweis: Das Gesamtvolumen der roten A / B Mix basiert auf der Anzahl und Größe der Gewebeschnitte. Für einen 0,75 '' x 0,75 '' reicht 120 µL für einen Abschnitt. Verwenden Sie die Mischung innerhalb von 5 min und direktem Sonnenlicht oder UV-Licht meiden Sie der Mischung.</li>
			<li>Schließen Sie das Fach und inkubieren Sie für 10 min bei RT. entfernen Sie die Lösung für einen Abfallcontainer und sofort waschen Rack einfügen Sie die Folien und platzieren Sie die Zahnstange in einer Wasch-Schale mit Leitungswasser gefüllt. Wieder mit frischem Leitungswasser abspülen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gegenfärbung der Folien
	<ol>
<li>Entfernen Sie das Waschen Rack aus Leitungswasser und schnell tippen auf saugfähigem Papier, extra Wasser zu entfernen. Das Rack in einem 50 % Hämatoxylin Färbelösung und sofort bewegen Sie das Gestell nach oben und unten mehrmals. 2 min bei RT inkubieren</li>
		<li>Überweisen Sie Folie-Rack zurück auf das Leitungswasser Gericht. Waschen Sie 3 – 5 Mal durch das Rack rauf und runter bewegen und frisches Leitungswasser zu wechseln, bis die Folien deutlich werden, während das Hirngewebe lila bleiben.</li>
		<li>Bewegen Sie das Rack, eine Schale mit 0,02 % Ammoniakwasser. Das Rack hoch und runter bewegen Sie 2 – 3 Mal bis das Gewebe blau leuchten. Waschen Sie die Objektträger 3 – 5 Mal mit frischem Leitungswasser in einer Färbung Schale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage der Proben
	<ol>
<li>Verschieben der Folie-Rack aus der Färbung Schale in einem 60 ° C Inkubator und mindestens 15 min inkubieren, bis die Folien vollständig trocken sind.</li>
		<li>40 µL Eindeckmedium auf der Folie und legen Sie ein 24 mm x 50 mm-Deckglas vorsichtig über Abschnitt Gewebe. Luft trocken Folien für 30 min bei RT</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Datenerhebung und-Analyse
Hinweis: Verwenden Sie einen Diascanner zum Scannen von Bildern bei 40 X Vergrößerung.
<ol><li>
Positive und negative Kontrollen
	<ol>
<li>Für jedes Experiment sind positive und negative Kontrollen (Abbildung 3). Als eine gute positive Kontrolle sollte Signal als punktförmige Punkte bei 20-40 X Vergrößerung sichtbar sein.</li>
		<li>Verwendung der Maus (Mm) - PPIB - 1ZZ als Positivkontrolle. Diese Sonde zielt auf einen gemeinsamen Haushalt gen PPIB. Für negative Kontrolle geht einen Punkt für jeden 20 Zellen mit Hintergrund Färbung pro 20 X Mikroskop-Feld angezeigt.</li>
		<li>Verwenden Sie die DapB-1ZZ Sonde als Negativkontrolle. Diese Sonde zielt auf die bakterielle gen DapB. Diese Kontrolle Sonden wurden in vielen ISH Assays19verwendet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Signalerkennung und Analyse von als Expressionsmuster von Nf1 Exon 23a
	<ol>
<li>Zählen Sie die Hybridisierung Signale als punktförmige Punkte angegeben sind, die Punkte manuell. Die Anzahl der Punkte korreliert mit dem Niveau der Abschriften, die von einer speziellen Sonde erkannt wird. Beachten Sie, dass die Anzahl der Punkte auch mit ImageJ oder SpotStudio Software analysiert werden kann.</li>
		<li>Verwenden Sie drei Sonden um zu hybridisieren Exon 23a-haltigen, Exon 23a fehlt Isoformen oder total Nf1 Transkripte (Abbildung 2). Da die drei Sonden gleichzeitig verwendet werden können, verwenden Sie drei angrenzende Gehirn Gewebeschnitte für jede Sonde hybridisieren.<ol>
<li>Um Prozent gespleißt in (PSI) für Exon 23a zu berechnen, die Anzahl der Zellen und Punkte in verschiedenen Hirnregionen. Zählen Sie für jede Region von Interesse mehr als 400 Zellen aus mehreren Sub-Regionen wie in Abbildung 4dargestellt.</li>
			<li>Sammeln von Daten aus den gleichen Subregionen für jede der drei Sonden. PSI als Anzahl der Punkte pro Zelle zu berechnen, mit der Exon 23a Aufnahme Sonde / (Anzahl der Punkte pro Zelle mit dem Exon 23a Aufnahme Sonde + Anzahl der Punkt pro Zelle mit der exon23a Sonde überspringen) x 100 %.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease.">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li><li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease.">RNA splicing. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Diese Mitteilung berichtet die Verwendung von BaseScope RNA-ISH, als Expressionsmuster Maus Gehirn abschnittsweise zu prüfen. Es wird gezeigt, dass diese Anti-Sense Exon-Exon-Junction-Sonden kürzer als 50 Nukleotide Exon Eingliederung und überspringen Isoformen, robust und speziell ansprechen kannst. Darüber hinaus können die resultierenden Signale zur PSI eine alternative Exon berechnen.
Ein paar Variationen wurden in dem Verfahren getestet. Z. B. wurden gefrorene Gewebeschnitte von Kryo...

Alternatives Spleißen (AS) ist ein gemeinsamer Prozess, der auftritt, während der Pre-mRNA-Reifung. In diesem Prozess kann ein Exon differentiell in Reife mRNA aufgenommen werden. So kann durch AS, ein Gen viele mRNAs, dass Code für verschiedene Proteinprodukte generieren. Es wird geschätzt, dass 92 – 94 % der menschlichen Gene alternative Spleißen1,2unterziehen. Abnorme Alternative Spleißen Muster ergab sich aus genetische Mutationen zu einer Vielzahl von Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose, myotonische Dystrophie und Krebs3,4in Verbindung gebracht worden. Es ist somit entscheidend zu untersuchen und zu alternative Spleißen regulatorische Mechanismen besser zu verstehen, in einem Versuch, neue Behandlungen von Krankheiten des Menschen zu finden.
WIE oft in einer Zelle Typ-spezifische Art und Weise geregelt ist. Es ist wichtig, das AS Expressionsmuster eines bestimmten Gens in einem bestimmten biologischen System zu bestimmen. Dies wird jedoch kompliziert, wenn ein komplexes Organ, das viele verschiedene Arten von Zellen, wie Gehirn oder Herz, enthält studiert wird. In diesem Fall ist eine ideale Wahl Testsystem RNA in Situ Hybridisierung (ISH) mit Gewebe Abschnitte so AS Ausdrucksmuster eines bestimmten Gens in vielen Zelltypen gleichzeitig erkannt werden. In der Tat wurden Exon-spezifischen Sonden zur Ausdruck Niveaus ein alternative Exon5,6,7festzusetzen. Dieser Ansatz ist jedoch nicht gut geeignet für als Muster Analyse aus den folgenden Gründen. Erste, konventionelle ISH Methoden verwenden in der Regel länger als 300 Sonden bp, während die durchschnittliche Größe der vertebrate internen Exons (nicht vor- oder Nachnamen Exon) 170 Nukleotide8,9. Zweitens Wenn eine Exon-spezifische Sonde verwendet wird, um das Spleißen Muster eine interne alternative Exon untersuchen, ist die einzige mRNA-Isoform erkannt von der Sonde derjenige, der das Exon, während die mRNA-Isoform enthält, ohne das Exon erkannt werden kann. Berechnung der gespleißt (PSI) Wert für das alternative Exon Prozent ist so kompliziert. Darüber hinaus verbindet konventionelle Leuchtstofflampen ISH ISH oft mit Immunostaining, das reduziert die nachweiseffizienz und Robustheit. Zum Beispiel in einer Studie, die untersucht die stressinduzierte Spleißen Isoform Schalten von Acetylcholinesterase (AChE) mRNA, Digoxigenin wurde in die ISH-Sonde aufgenommen und mit Anti-Digoxigenin-Antikörper nachgewiesen. Alternativ wurde Biotin-markierten Sonde durch eine alkalische Phosphatase/Streptavidin-Konjugat und Substrat für alkalische Phosphatase10festgestellt. Weder-Methode verwendet Verstärkung Strategie, um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen. Infolgedessen ist es schwierig um zu mRNA Transkripte zu erkennen, die auf einem niedrigen Niveau zum Ausdruck kommen. Daher ist eine einfachere und robustere ISH-Assay-System erforderlich, um als Ausdruck Muster in Situzu analysieren.
BaseScope wurde vor kurzem entwickelt, basierend auf der Plattform des RNAscope, eine gut etablierte und weit verbreitete ISH Testsystem. Beide Test-Systeme setzen eine gezielt Verstärkungstechnologie, die erhöht die Empfindlichkeit der Erkennung11,12. Was man von den anderen unterscheidet, ist die Länge der Zielsequenz, die so kurz wie 50 Nukleotide für BaseScope und 300 – 1.000 Nukleotide für RNAscope ist. Somit ist es möglich, Design-Sonden, die auf Exon-Exon-Kreuzungen, spezifische alternative mRNA-Isoformen zu erkennen. In der aktuellen Studie wurde ein Verfahren eingesetzt, um zu prüfen wie Expressionsmuster der Neurofibromatose 1 (Nf1) Exon 23a, eine alternative Exon ausgiebig studiert in der gleichen Labor13,14,15 Typ , 16 , 17in Maus Gehirn Abschnitten. Die Ergebnisse zeigen, dass BaseScope ein ideales System, Expressionsmuster von Nf1 Exon 23a in Situzu studieren. Da diesem Testsystem analysieren als Expressionsmuster von vielen Alternativen Exons angepasst werden kann, stellt es ein leistungsfähiges neues Tool in den Studien der AS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>241000ACD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Control Tray (with lid)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain Rack</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1160049SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imperial III General Purpose Incubator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td>302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Scanner</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SCN400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pretreatment kit</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>322381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2000899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease III*</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2000901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Target Retrieval</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2002555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaseScope Detection Reagent Kit</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>332910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 0</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 1</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 2</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 3</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 4</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>16229B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 5-RED</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>16229C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 6-RED</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast RED-A</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast RED-B</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>16230F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X Wash Buffer</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>701021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>701081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control slide-mouse 3T3 cell pellet</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifying Paper</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Rack</td>
			<td>American Master Tech Scientific</td>
			<td>9837976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Dishes</td>
			<td>American Master Tech Scientific</td>
			<td>LWS20WH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector Laboratory</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass, 24 x 50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12--545-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>002689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (EtOH)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formalde solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF94-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin I</td>
			<td>American Master Tech Scientific</td>
			<td>17012359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>173942</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay

Alternatives Spleißen (AS) tritt in mehr als 90 % der menschlichen Gene. Das Muster des Ausdrucks einer Alternativ gespleißten Exon wird oft in einer Zelle Typ-spezifische Art und Weise geregelt. ALS Ausdruck, die Muster sind in der Regel durch RT-PCR und RNA-Seq analysiert mit RNA-Proben von einer Bevölkerung der Zellen isoliert. In Situ Untersuchung als Expressionsmuster für eine bestimmte biologische Struktur kann durch RNA in Situ Hybridisierung (ISH) mit Exon-spezifischen Sonden durchgeführt werden. Jedoch wurde diese besondere Verwendung des ISH beschränkt, weil alternative Exons in der Regel zu kurz, um Exon-spezifischen Sonden zu entwerfen. In diesem Bericht wird die Verwendung von BaseScope, eine neu entwickelte Technologie, die kurze antisense Oligonukleotide in RNA ISH beschäftigt beschrieben als Expressionsmuster in Maus Gehirn Abschnitten zu analysieren. Exon 23a der Neurofibromatose Typ 1 (Nf1) dient als ein Beispiel zur Veranschaulichung, dass kurze Exon-Exon-Junction-Sonden robuste Hybridisierung Signale mit hoher Spezifität in RNA ISH Analyse auf Maus Gehirn Abschnitte aufweisen. Noch wichtiger ist, können Signale mit Exon Aufnahme und überspringen-spezifische Sonden erkannt verwendet werden, die Werte von Nf1 Exon 23a Ausdruck in verschiedenen anatomischen Bereichen des mausgehirns einer gespleißt Prozent zuverlässig berechnen. Die experimentelle Protokoll und Berechnungsmethode für die Analyse werden vorgestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass BaseScope bietet ein leistungsfähiges neues Tool als Ausdruck Muster in Situbewerten.

BaseScope ISH erfolgte nach drei Mausstämme: CD1 Wildtyp-Mäusen C57BL/6J Wildtyp-Mäusen und Nf123aIN/23aIN mutierte Mäuse im C57BL/6J Hintergrund, in denen Exon 23a in allen Zelltypen infolge eines enthalten ist entwickelt Spleiß-Website Mutationen-14,-15.
Als ersten Schritt, das ISH Assay System wurde getestet mit Unternehmen zur Verfügung ges...

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Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Eine in Situ Hybridisierung (ISH) Protokoll, die kurze antisense Oligonukleotide verwendet, um alternative Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitte erkennen wird beschrieben.

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

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Genetics

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

8.8K Aufrufe.  Case Western Reserve University. Eine in Situ Hybridisierung (ISH) Protokoll, die kurze antisense Oligonukleotide verwendet, um alternative Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitte erkennen wird beschrieben.

Serie: Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which specifically binds the pre-mRNA target and an effector domain. Previously, we have taken advantage of the unique RNA binding mode of the PUF domain in human Pumilio 1 to generate a programmable RNA binding scaffold, which was used to engineer various artificial RBPs to manipulate RNA metabolism. Here, a detailed protocol is described to construct Engineered Splicing Factors (ESFs) that are specifically designed to modulate the alternative splicing of target genes. The protocol includes how to design and construct a customized PUF scaffold for a specific RNA target, how to construct an ESF expression plasmid by fusing a designer PUF domain and an effector domain, and how to use ESFs to manipulate the splicing of target genes. In the representative results of this method, we have also described the common assays of ESF activities using splicing reporters, the application of ESF in cultured human cells, and the subsequent effect of splicing changes. By following the detailed protocols in this report, it is possible to design and generate ESFs for the regulation of different types of Alternative Splicing (AS), providing a new strategy to study splicing regulation and the function of different splicing isoforms. Moreover, by fusing different functional domains with a designed PUF domain, researchers can engineer artificial factors that target specific RNAs to manipulate various steps of RNA processing.

This report describes a bioengineering method to design and construct novel Artificial Splicing Factors (ASFs) that specifically modulate the splicing of target genes in mammalian cells. This method can be further expanded to engineer various artificial factors to manipulate other aspects of RNA metabolism.

Engineering künstliche Faktoren zur Speziellen Manipulation alternativen Spleißen in menschlichen Zellen

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Forschung

Genetik

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

Gewebespezifische MiRNA Expression Profiling in Maus Herz Abschnitte In Situ Hybridisierung

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

Mit In-vitro- und In der Zelle Form zu untersuchen, kleines Molekül induzierte Pre-mRNA Strukturveränderungen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Verwendung von einzelnen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SM-Fisch), Quantify und Localize mRNAs in murinen Eizellen

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated with a better outcome than alcohol- and tobacco-related OPSCC. Chromogenic in situ hybridization (CISH) of HPV viral RNA could allow the semiquantitative evaluation of viral transcripts of the oncogenic proteins E6 and E7 and an in situ visualization with a good spatial resolution. This technique allows the diagnosis of an active infection with the visualization of HPV transcription in the tumoral HPV-infected cells. An advantage of this technique is the avoidance of contamination from nonneoplastic HPV-infected cells adjacent to the tumor. Overall, its good diagnosis performances have it considered to be the gold standard for active HPV infection identification. Since E6 and E7 viral protein interaction with cell proteins pRb and p53 is mandatory for cell transformation, HPV RNA CISH is functionally relevant and acutely reflects active oncogenic HPV infection. This technique is clinically relevant as well since &#34;low&#34; or &#34;high&#34; HPV transcription levels helped the identification of two prognosis groups among HPV-related p16-positive head and neck cancer patients. Here we present the protocol for manual HPV RNA CISH performed on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) slides with a kit obtained from the manufacturer. Instead of chromogenic revelation, RNA in situ hybridization may also be performed with fluorescent revelation (RNA FISH). It may also be combined with conventional immunostaining.

Human papillomavirus (HPV) RNA chromogenic in situ hybridization is considered to be one of the gold standards for active human papillomavirus infection detection within tumors. It allows the visualization of HPV E6-E7 mRNA expression with localization and semiquantitative evaluation of its signal.

Chromogene In-Situ-Hybridisierung ist ein Tool für hpV-bezogene Kopf- und Halskrebsdiagnose

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.