Der konstante Druck innerhalb der Fixiervorrichtung hält die Lunge in einem einigermaßen aufgeblasenen Zustand und erzeugt eine histologische Lungenprobe, die für die Beurteilung von mild Zigarettenrauch induziertem Emphysem geeignet ist. Der Hauptvorteil dieses Modells ist, dass es viele Lungen gleichzeitig mit dem gleichen konstanten Druck ohne Lungenkollaps oder Deflation fixieren kann. Demonstriert das Verfahren wird Naoko Arano ein Student aus meinem Labor sein.
Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Reflexbewegung machen einen Schnitt in der Haut und Muskelgewebe entlang der medialen Linie der Maus, Ziel für die Cephalie-Region, und schneiden seitlich, um einen breiteren Arbeitsbereich zu schaffen. Nach der Exposition der Membranschicht punktieren Sie das Gewebe mit Zangen und öffnen Sie den Brustraum. Schneiden Sie den Sternbereich, so dass die Lunge und das Herz visualisiert werden können.
Und schneiden Sie das linke Atrium und den rechten Ventrikel. Legen Sie eine 24 Gauge Kanüle, die mit einer Perfusionspumpe verbunden ist, in den rechten Ventrikelbereich ein und leiten Sie die Kanüle in den Cephalabereich, bis sie die Lungenarterie erreicht. Schalten Sie dann die Pumpe ein und durchdringen Sie das Gewebe mit etwa 200 MilliliterPBS für eine Stunde, bis sich das gesamte Lungengewebe in eine weiße Farbe geändert hat.
Am Ende der Perfusion schneiden Sie das Bindegewebe um die Luftröhre, Lunge und Herz, und verwenden Sie eine Naht, um die rechten Hauptbronchus zu binden. Als nächstes ernten Sie alle einzelnen Lappen der rechten Lunge und legen Sie das Herz und die Lappen der linken Lunge in einzelne 10-Milliliter-Spritzen, die ein entsprechendes Fixativ enthalten. Ziehen Sie den Kolben ein, wodurch ein Vakuum in der Spritze entsteht, um die Lunge aufzublasen und die Lunge aus der Spritze zu entfernen.
Legen Sie eine 20 Gauge Kanüle in die Luftröhre und verwenden Sie eine Naht, um die Kanüle an Ort und Stelle zu sichern. Schließen Sie eine mit Fixativ gefüllte Milliliterspritze an die Kanüle an und füllen Sie die Lunge mit zusätzlichem Fixativ, um auf Leckagen zu überprüfen. Stellen Sie sicher, dass die Einsteckstelle gesichert wurde, um zu verhindern, dass sich die Lungenprobe während der Fixierung von der Lungenplatine löst.
Dann übertragen Sie das Gewebe auf die Lungenfixierung Druckgeräte, entfernen Sie die Probe und binden Sie die Luftröhre mit einem Knoten am Ende der Fixierungsphase. Die untere Komponente der Lungenfixierungsdruckausrüstung, in die die Lungenprobe eingeführt wird, wird über eine 20-Spur-Kanüle mit einem Drei-Wege-Stopphahn an die Spitze des Formalinstroms angeschlossen. Der Druck wird aus den unterschiedlichen Oberflächenebenen des Fixativs zwischen dem unteren und oberen Fach erzeugt.
Der Druckunterschied beträgt 25 Zentimeter Wasser, aber der Höhenverstellknopf kann verwendet werden, um den Druck auf zwischen 25 und 30 Zentimeter Wasser einzustellen. Eine Pumpe verbindet den unteren und oberen Behälter, wobei ein Unterschied von 25 Zentimetern in der fixativen Oberflächenhöhe erhalten bleibt, und leitet den Fluss des Mittels. Nach 48 Stunden Fixierung weisen die Lungen von SMP30-Knockout-Mäusen, die der Umgebungsluft ausgesetzt sind, keine deutliche Luftraumvergrößerung auf.
Signifikante Luftraumvergrößerung und Zerstörung der Alveolarwand werden jedoch bei SMP30-Knockout-Mäusen beobachtet, die chronischem Zigarettenrauch ausgesetzt sind. Darüber hinaus sind der mittlere lineare Abfang- und destruktiver Index der Lungenproben in den rauchexponierten SMP30-Knockout-Mäusen signifikant größer als in den luftexponierten Tieren. Unser Labor verwendet 10%formalin, aber Forscher können andere Fixierungsmittel entsprechend ihren experimentellen Bedürfnissen verwenden.
Wie wir berichtet haben, können mit dem demonstrierten Fixierungssystem Lungenproben aus verschiedenen Mausemphysemmodellen für ihre morphometrische Auswertung geerntet werden. Da Fixiermittel gefährlich sein können, tragen Sie immer die entsprechende Schutzausrüstung des Personals und arbeiten in einem gut belüfteten Raum.
