Nichtsimulatorische Peptid-MHC-Komplexe aktivieren keine T-Zellen, sondern können die T-Zell-Antworten auf agonistischePeptid MHC verbessern. Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles System zur Untersuchung des Co-Agonismus während der Aktivierung menschlicher CD8-T-Zellen. Wir exprimierten MHC-Moleküle als einkettige Komplexe mit kovalent-verknüpfter schwerer Kette, Beta-2-Mikroglobulin und dem Peptid.
Dies ermöglicht die Einführung von Mutationen in MHC-Moleküle, die vorbestimmte Peptide aufweisen. Dieses Protokoll verwendet den menschlichen CTN-Klon, ein spezifisches Epitop des Hepatitis-B-Virus. Das Verständnis des Mechanismus des Koagonismus während der Reaktion von T-Zellen gegen Hepatitis kann zur Entwicklung von Immuntropika gegen diese Virusinfektion beitragen.
Die vorgestellten Methoden können in der Forschung und anderen grundlegenden Aspekten der T-Zellaktivierung in menschlichen T-Zellsystemen mit bekannter Peptid-MHC-Spezifität eingesetzt werden. Dieses Protokoll verwendet einkettige menschliche MHC-Moleküle der Klasse I, bestehend aus Signalsequenz, Peptid von Interesse, Linker, humanem Beta-2-Mikroglobulin-Linker und MHC-Schwerkette. E1A3-Peptid von Hepatitis B wird als agonistes Peptid verwendet.
Gag von HIV wird als nichtstimulatorisches Peptid verwendet. Die einkettigen menschlichen MHC-Moleküle werden in einer Hamsterzelllinie exprimiert, die Tetracyclin-Repressor enthält. Agonist einkettiges MHC wird mit Tetracyclin-induziblem Plasmid exprimiert, was zu sehr niedrigen Expressionswerten in Abwesenheit von Tetracyclin und hohen Expressionswerten in Gegenwart von Tetracyclin führt.
CHO-Zellen, die niedrige Konzentrationen von agonistischem Peptid MHC exprimieren, werden mit konstitutiv exprimierendem nichtstimulatorischem Peptid MHC transfiziert. Die Verwendung dieses experimentellen Systems ermöglicht den Vergleich von T-Zell-Antworten auf agonistische Peptid MHC in Gegenwart oder Abwesenheit von nichtstimulatorischem Peptid MHC. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, kultivieren Sie CHO-Zellen in einem T-75-Kolben, wie im Textprotokoll beschrieben.
Waschen Sie am Tag vor dem T-Zell-Aktivierungsexperiment die Zellen im Kolben mit PBS. Fügen Sie eine Lösung hinzu, die 05%Trypsin und 2%EDTA in PBS enthält, und brüten sie fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur. Beobachten Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass sie sich gelöst haben.
Fügen Sie dann vollständige F12 in den Kolben, um die Trypsinisierung zu stoppen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Rohr. Zentrifugieren Sie bei 400G für fünf Minuten, und entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren oder Dekantieren.
Setzen Sie das Zellpellet in fünf Millilitern vollständiger F12 wieder auf. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen, und passen Sie die Zellkonzentration auf 200.000 Zellen pro Milliliter in CF12 an. Fügen Sie den agonistischen Proben 50 bis 60 Nanogramm pro Milliliter Tetracyclin hinzu, um hohe Mengen an agonistischer pMHC-Klasse I-Expression als positivzusteuern.
Danach mischen Sie die CHO-Zellen entweder durch Wirbeln oder Pipettieren. Fügen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension zu jedem Brunnen einer U-Boden 96-Well-Platte hinzu. Über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren.
Am Tag vor dem Experiment zentrifugieren CTLS-Zellen bei 400 mal G und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen, und setzen Sie sie mit einer Dichte von einer Million Zellen pro Milliliter in vollständigen menschlichen T-Zellmedien ohne Zytokine oder PHA wieder aus. Inkubieren Sie die CTLs über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die T-Zellen bei 400 mal G und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in 2 Millilitern vollständiger serumfreier Medien wieder aus. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die T-Zellen zu zählen, und passen Sie ihre Dichte auf eine Million lebende Zellen pro Milliliter in vollständigen menschlichen T-Zellmedien an.
Fügen Sie antihumane CD107a-Antikörper bei einer einbis 100 Verdünnung und Brefeldin A bei einer verdünnten Eins bis 1000 hinzu. Rufen Sie als Nächstes die 96-Well-Platte ab, die die CHO-Zellen enthält. Mit einer gläsernen Pasteurpipette die Medien aus den CHO-Zellen ansaugen.
Fügen Sie 200 Mikroliter der T-Zellsuspension zu jedem Brunnen hinzu. Kokultur ieren die T-Zellen mit CHO-Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für drei bis vier Stunden. Am Ende der Co-Kultur zentrieren Sie die 96-Well-Platte bei 400 mal G und vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Entfernen Sie den Überstand, indem Sie ihn anheben oder streicheln. Dann fügen Sie 2,5 Mikroliter CD3-Antikörper und 2,5 Mikroliter CD8-Antikörper in 50 Mikroliter 5%BSA in PBS zu jedem Brunnen, für Zelloberflächen-Antigenfärbung, und mischen durch Pipettieren. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln und auf Eis, für 30 Minuten.
Danach 150 Mikroliter Waschpuffer zu jedem Brunnen hinzufügen, um die Proben zu waschen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 400 mal G und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie ihn anheben oder streicheln.
Legen Sie ein Fixierungs-/Permeabilisierungskit fest und fügen Sie jedem Brunnen 100 Mikroliter Fixierungs-/Permeabilisierungslösung hinzu, und Pipette zum Mischen. 20 Minuten auf Eis bebrüten. Dann zentrifugieren Sie die Platte bei 400 mal G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 200 Mikroliter 1X Perm/Waschpuffer zu jedem Brunnen hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang aus der Zentrifugation, indem Sie einmal den Perm/Waschpuffer hinzufügen. Danach setzen Sie die Zellen in 50 Mikroliter Perm/Waschpuffer, der Anti-Interferon-Gamma enthält, in einer Konzentration von 3 Mikrogramm pro Milliliter wieder aus.
30 Minuten auf Eis im Dunkeln bebrüten. Als nächstes fügen Sie 150 Mikroliter 1X Perm/Waschpuffer hinzu. Zentrifuge bei 400G, vier Grad Celsius, für fünf Minuten.
Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 200 Mikroliter 1X Perm/Waschpuffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Platte wieder bei 400 mal G, vier Grad Celsius, für fünf Minuten, und entfernen Sie den Überstand durch Anheben oder Streichen. Setzen Sie die Probe in 200 Mikroliter Waschpuffer wieder aus und fahren Sie mit der zytometrischen Analyse fort.
Mischen Sie die CHO-Zellen einen Tag vor dem Experiment entweder durch Wirbeln oder Pipettieren. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter der Zellsuspension zu jedem Brunnen einer 12-Well-Platte hinzu. Über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren.
Verwenden Sie am Tag des Experiments einen Zellschaber, um die CHO-Zellen von der Unterseite jedes Brunnens zu lösen. Übertragen Sie den einen Milliliter Medien, der die Zellen von jedem Brunnen enthält, in FACS-Röhren. Zentrifuge bei 400 mal G und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Re-suspend in 100 Mikroliter Anti-HLA-Antikörper im Waschpuffer verdünnt. 30 Minuten auf Eis bebrüten. Fügen Sie dann jeder CHO-Probe einen Milliliter Waschpuffer hinzu.
Zentrifugieren Sie bei 400 mal G und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten, und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie jede Probe in 3 Milliliter Waschpuffer wieder aus, und führen Sie die Analyse der Zytometrie durch. In dieser Studie wird ein robustes Werkzeug zur Untersuchung der molekularen Interaktion während der positiven T-Zellaktivierung durch humanes CD8 vorgestellt.
Es wird ein technisch entwickeltes xenogenes System erzeugt, das in Gegenwart oder Abwesenheit von Co-Agonist enpHC niedrige Konzentrationen von agonistischem pMHC darstellt. Diese konstruierten APCs werden dann verwendet, um einen E183-spezifischen menschlichen CD8-positiven T-Zellklon zu stimulieren. Untransfizierte CHO-Zellen und CHO-Zellen, die den nichtstimulatorischen einkettigen Gag-MHC-Komplex exprimieren, induzieren keine Aktivierung.
Die Expression des agonistischen einkettigen E183-MHC-Komplexes, der die positive Kontrolle ist, ist die Art und Weise, dass eine sehr effiziente Interferon-Gamma-Produktion und Degranulation induziert wird, was zeigt, dass das einkettige E183-Konstrukt von einer bestimmten TCR erkannt werden kann, um T-Zell-Effektor-Funktionen zu aktivieren. Die Expression niedriger Einketten-E183-MHC-Komplexe induziert ein geringeres Maß an Interferon-Gamma-Produktion und Degranulation, was durch das Vorhandensein eines nichtstimulatorischen Gag-MHC-Komplexes verstärkt wurde. Beachten Sie, dass sehr hohe Prozentsätze von CD107a+T-Zellen auch als Reaktion auf niedrige Konzentrationen von antigenen pMHC beobachtet werden, was mit früheren Studien übereinstimmt.
Jedoch, Vorhandensein von nichtstimulatory Gag-MHC-Komplex erhöht CD107a MFI. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, agonistische Peptid-MHC-Expression zu kontrollieren, um eine gleichberechtigte agonistische Darstellung mit oder ohne nicht-stimulatorisches Peptid zu gewährleisten. Es ist wichtig, die agonistische Peptid-MHC-Expression mit TCR-ähnlichen Antikörpern in jedem Experiment zu quantifizieren.
Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung von unterstützten Lipid-Bilayern oder Perlen, die eine feste Menge an agonistischem Peptid MHC in Gegenwart von nichtstimulatorischem Peptid MHC darstellen. Dieses experimentelle System sollte das Testen mehrerer nichtstimulatorischer Peptidsequenzen auf Co-Agonismus ermöglichen. Die einkettige MHC-Technologie kann zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen bei der CD4-T-Zellaktivierung sowie zur Untersuchung nicht-klassischer MHC-Moleküle eingesetzt werden.
Dieses Protokoll verwendet menschliches Blut und menschliche Zellen. Befolgen Sie alle notwendigen Vorsichtsmaßnahmen bei der Arbeit mit menschlichem Blut, um das Risiko der Übertragung von blutübertragenen Krankheiten zu reduzieren.
