Inositolphosphat und Phosphoinositide sind Metaboliten, die mehrere regulatorische Funktionen in Eukaryoten haben, einschließlich der Kontrolle der Genexpression, Proteinhandel, Signaltransduktion und Zellentwicklung. Sie erfüllen diese regulatorische Funktion durch Bindung an Proteine und verändern dadurch die Proteinkonformation, katalytische Aktivität oder Proteinwechselwirkungen. Die Identifizierung von Proteinen, die an Inositphosphat oder Phosphoinositide binden, ist wichtig, um zu verstehen, wie diese Metaboliten ihre regulatorische Funktion erfüllen.
Dieses Protokoll verfügt über einen einfachen Workflow, der empfindlich, nicht radioaktiv, lyposomefrei ist und Reagenzien verwendet, die im Handel erhältlich sind. Bei dieser Methode wird eine fertige Chromatographie mit biotinyolphosphat oder Phosphoinositiden verwendet, um interagierende Proteine zu isolieren, sie werden dann durch Western Blot oder Massenspektrometrie identifiziert. Für Blutstromformen, wachsen T.brucei Zellen bis zur mittleren Log-Phase in HMI-9-Medien, ergänzt mit 10%FBS, bei 37 Grad Celsius, mit 5%Kohlendioxid.
Halten Sie die Zelldichte zwischen 800, 000 und 1,6 Millionen Zellen pro Milliliter. Wenn sie bereit sind, zentrieren Sie die Zellen bei 1600 mal G und bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet vorsichtig in 10 Milliletres PBS-G vorerhitzt bei 37 Grad Celsius, um die Zellen zu waschen.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1600 mal G und bei Raumtemperatur für fünf Minuten, um die Wäsche abzuschließen. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch zweimal. Dann setzen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS-G wieder auf.
Übertragen Sie diese Suspension auf ein Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Rohr, dann Zentrifuge bei 1600 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in Nullpunkt fünf Milliliter Lysepuffer, ergänzt mit einem Punkt fünf X Protease-Hemmer-Cocktail, und ein X Phosphatase-Hemmer-Cocktail, der auf Eis vorgekühlt wurde, um die Zellen zu lysieren. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 1400 mal G und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Danach sammeln Sie den Überstand, der die extrahierten Parasitenproteine enthält, in eine neue Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Röhre für die Bindungstests. 5 % des gesamten Lysats für die Western Blot-Analyse beiseite legen. Sammeln Sie 50 Mikroliter Inositolphosphate oder Phosphoinositide konjugiert zu Agarose Perlen, und fügen Sie sie 500 Milliliter Bindungpuffer.
Zentrifuge bei 1000 mal G für eine Minute. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie ihn in 50 Mikroliter Bindungspuffer aus, um die Perlen auszulagern. Verwenden Sie nicht konjugierte Perlen als Kontrolle, und verwenden Sie Perlen mit verschiedenen Phosphatkonfigurationen, einschließlich nicht-phosphorylierter Formen, um unspezifische Wechselwirkungen zu kontrollieren.
Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter IP- oder PI-Perlen in das Zelllysat oder die gereinigten Proteine ein. Halten Sie das Volumen der Perlen innerhalb von 10% des gesamten Lysats. Verwenden Sie ggf. den Bindungspuffer, um das Volumen der Bindungsreaktion anzupassen.
Inkubieren Sie die Reaktion entweder für eine Stunde oder über Nacht bei vier Grad Celsius, während sie sich bei 50Rpm dreht. Danach zentrifugieren Sie die Mischung bei 1000 mal G, und bei vier Grad Celsius für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand, und halten Sie das Pellet, stellen Sie sicher, 5% des Überstandes für western Blot Analyse zu halten.
Dann fügen Sie einen Milliliter Waschpuffer und tippen oder wirbeln Sie das Rohr, um das Harz wieder aufzuhängen. Zentrifugieren Sie die Reaktion bei 1000 mal G und bei vier Grad Celsius für eine Minute, und werfen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt fünf Wähbe.
Danach 50 Mikroliter 2X Laemmli Puffer mit 710 Millimolar 2-Mercaptoethanol zu den Perlen ergänzen. Tippen oder Wirbel, um die Proteine zu mischen, und verdünnen Sie sie. Als nächstes erhitzen Sie bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten, und Zentrifuge bei 10.000 mal G für eine Minute.
Sammeln Sie den Überstand, und frieren Sie entweder das Eluat bei minus 80 Grad Celsius, oder gehen Sie zur Western Blot Analyse. Die hier vorgestellte Methode wird verwendet, um die Bindung von PIs durch Repressor-Aktivatorprotein 1 aus T.brucei Lysat oder durch rekombinantes T.brucei Repressor-Aktivatorprotein 1 Protein 1 zu analysieren. Da RAP1 kanonische PI-Bindungsdomänen fehlen, werden die Bindungstests mit PIs durchgeführt, die nicht phosphoryliert sind oder die an verschiedenen Positionen des Inositolrings phosphoryliert sind, und mit nicht konjugierten Agaroseperlen.
Die westliche Analyse zeigt, dass RAP1 bevorzugt an PI(3, 4, 5)P3-Perlen bindet, aber auch in geringerem Maße an PI(4, 5)P2-Perlen bindet. Es bindete jedoch nicht an andere PIs oder Agarose-Perlen. Um zu testen, ob RAP1 direkt an PIs bindet, wird ein C-terminal mit 6XHis rekombinantem RAP1-Protein versehen und von E.Coli zur Homogenität gereinigt.
Western Blotting zeigt, dass die Erhöhung der Konzentration von PI(3, 4, 5)P3, aber nicht PI(4, 5)P2, die Wechselwirkung von rekombinantem RAP1 mit PI(3, 4, 5)P3 Perlen hemmt. Die Zugabe von T.brucei gereinigtPIP5Pase Enzym der Reaktion wiederhergestellt PI(3, 4, 5)P3 Bindung durch rekombinante RAP1. Dies ist auf die PIP5Pase-Dephosphorylierung der freien PI(3, 4, 5)P3 zurückzuführen und weist somit darauf hin, dass das Phosphorylierungsmuster dieses Metaboliten für unsere RAP1-Bindung unerlässlich ist.
T.brucei-Proteine, die an Ins(1, 4, 5)P3 binden, werden dann durch Affinitätschromatographie gefolgt von Massenspektrometrie identifiziert. Die SDS-PAGE-Analyse zeigt die Anreicherung von Proteinen, die von Ins(1, 4, 5)P3-Perlen eluiert werden, im Vergleich zu Proteinen, die aus den Kontrollagaroseperlen eluiert werden. Die Massenspektrometrieanalyse der eluierten Proteine identifizierte über 250 Proteine, von denen 84 mit Ins(1, 4, 5)P3-Perlen angereichert waren, verglichen mit Kontrollperlen.
Die Anreicherung von Proteinen, die an Ins(1, 4, 5)P3 gebunden sind, im Vergleich zu Kontrollperlen, korreliert mit dem von SDS-PAGE nachgewiesenen Proteinsignal. Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist die Verwendung geeigneter Kontrollen, um bestimmte von nicht spezifischen Interaktionen zu unterscheiden. Wir empfehlen die Verwendung nicht konjugierter Agaroseperlen und mit Inositolphosphat oder Phosphoinositiden konjugierter Perlen mit verschiedenen Phosphatkonfigurationen, einschließlich nicht phosphorylierter Formen.
Diese Methode kann auf andere einzellige protozoische Parasiten angewendet werden, wie Trypanosoma cruzi, Leishmanie oder Plasmodium. Es kann auch leicht an andere Organismen angepasst werden, einschließlich Hefe oder Säugetierzellen. Diese Methode kann an die quantitative Massenspektrometrie wie SILAC gekoppelt werden, um dynamische Wechselwirkungen von Proteinen mit Inositphosphat oder Phosphoinostiden zu identifizieren.
In kann auch mit subzellulärer Fraktionierung kombiniert werden, um organelle spezifische Proteine zu identifizieren, die an diese Metaboliten binden. Dieser Ansatz hat dazu beigetragen, Proteine zu identifizieren, die an Inositolphosphat und Phosphoinositide in T.brucei, Säugetierzellen und Hefe binden. Es hat dazu beigetragen, neue Proteindomänen zu identifizieren, die an Phosphoinositide binden.
Es hat den Weg geebnet, um die regulatorische Funktion dieser Metaboliten, ihre Rolle bei der Genexpression, Zellentwicklung und Signaltransduktion in Eukaryoten zu verstehen. Einige der Reagenzien in diesem Protokoll sind giftig oder entzündlich. Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung, und, wenn nötig, arbeiten Sie in einer Dunstabzugshaube.
