Dieses Protokoll ermöglicht die Auflösung des periodischen Membranskeletts im Axon-Anfangssegment kultivierter Neuronen. Durch die Untersuchung der Lokalisation von Proteinen können Einblicke in die Funktion im periodischen Membranskelett gewonnen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Robustheit und Benutzerfreundlichkeit.
Die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie ist in der Lage, das periodische Skelett der Membran aufzulösen, und die Probenvorbereitung ist einfach und unkompliziert. Jeder, der bereits Erfahrung in der Fluoreszenzmikroskopie hat, kann diese Technik problemlos anwenden. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um das Signal-Rausch-Verhältnis während der Probenvorbereitung und Bildgebung zu maximieren.
Um zu beginnen, fixieren Sie die Neuronen mit 4% Paraformaldehyd für 12 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Deckglas einmal in 0,2%BSA in Phosphatpufferlösung und inkubieren Sie für 10 Minuten in einer 1%igen Lösung von Triton X in PBS bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Deckslip mit BSA in Phosphatpufferlösung, verdünnen Sie die Anti-Ankyrin-G-Antikörper mit BSA in einer Phosphatpufferlösung im Verhältnis eins zu 200.
Antikörperlösung in den Deckslip geben und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Zellen einmal in BSA-Phosphatpufferlösung einmal in 0,1%Triton X in Phosphatpufferlösung und einmal in Phosphatpufferlösung. Verdünnen Sie Fluoro 4 markiert, fügen Sie weitere sekundäre Antikörper in BSA-Phosphatpufferlösung hinzu und fügen Sie sie dem Deckglas hinzu.
Waschen Sie die Zellen einmal in BSA-Phosphatpufferlösung einmal in 0,1% Triton X in Phosphatpufferlösung, dann einmal in Phosphatpufferlösung. Bereiten Sie eine mikromolare Lösung aus markiertem Ferodin in Phosphatpufferlösung vor und fügen Sie sie den Zellen hinzu. Waschen Sie die Zellen einmal in Rinderserumalbuminphosphat-Pufferlösung einmal in 0,1% Triton X in Phosphatpufferlösung, dann einmal in Phosphatpufferlösung.
Um den Deckzettel auf einem Glasobjektträger zu montieren, tragen Sie einen Tropfen Befestigungsmedium auf einen Objektträger auf, tauchen Sie den Deckglas in deionisiertes Wasser und klopfen Sie ihn mit einem weichen Papiertuch an, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Legen Sie den Deckbeleg auf den Glasträger und inkubieren Sie ihn bei Raumtemperatur für 24 Stunden. Wenn möglich, konsultieren Sie vor der Bildgebung das Personal der Mikroskopieanlage und verwenden Sie einen Tauchölrechner, um das für die Probe geeignete Tauchöl auszuwählen.
Sobald die Proben fertig sind, stellen Sie sicher, dass die Deckzettel sauber und frei von Rückständen sind, indem Sie sie mit einer in Wasser oder Ethanol getauchten Baumwollspitze reinigen. Legen Sie die Probe in ein 3D-SIM-Mikroskop und suchen Sie die Zelle, um das Bild aufzunehmen. Stellen Sie die Leistung der relevanten Laserlinien ein.
Und die Belichtungszeiten, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren, ohne die Probe signifikant zu bleichen. Legen Sie die oberen und unteren Grenzen der Probe in der Z-Dimension fest und fahren Sie mit dem Abrufen eines Stapels fort. Führen Sie den Rekonstruktionsalgorithmus auf dem Stapel aus, um eine super aufgelöste Rekonstruktion zu erhalten.
Überprüfen Sie die Rekonstruktionen auf bekannte Artefakte und passen Sie gegebenenfalls die Parameter an, um sie zu korrigieren. Vergleichen Sie die SIM-Rekonstruktion mit einem Weitfeldbild, um Verbesserungen in der Auflösung zu beobachten. Verwenden Sie bei der Durchführung einer mehrfarbigen strukturierten Beleuchtungsmikroskopie den Ausrichtungsalgorithmus, um die verschiedenen Kanäle korrekt auszurichten, sobald eine zufriedenstellende Rekonstruktion abgeschlossen ist.
Aktinringe im periodischen Membranskelett haben ein charakteristisches periodisches Aussehen. Erstellen Sie ein Projektionsbild mit maximaler Intensität in der Bildanalysesoftware unter Verwendung aller Fokusebenen, in denen die Aktinringe sichtbar sind. Zeichnen Sie auf dem Projektionsbild mit maximaler Intensität eine senkrechte Linie über sichtbare benachbarte Ringe und zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität zusammen mit der Linienplotprofilfunktion der Software auf.
Um die mittlere Zwischenspitzenentfernung zu berechnen, notieren Sie sich die lokalen Maxima im Linienprofil und messen Sie den Abstand zwischen einzelnen benachbarten fluoreszierenden Intensitätsspitzen. Um die Kolokalisation verschiedener Proteine mit Aktinringen im periodischen Membranskelett zu bewerten, führen Sie ein Kolokalisierungsanalyseverfahren für SIM-Rekonstruktionen von Aktin und dem Kandidatenprotein durch. Ziehen Sie manuell eine Auswahl, um das Axon-Anfangssegment als Region von Interesse zu definieren, für das einfache Kolokalisierungs-Plugin in der Softwareplattform, und führen Sie die Analyse aus, um den Pearson-Korrelationskoeffizienten für die Kolokalisierung zu berechnen.
Während der SIM-Bildanalyse zeigten die Rekonstruktionen von Bildstapeln eine deutliche Periodizität von Aktinringen. Ein Anti-Ankyrin-G-Antikörper wurde verwendet, um Ankyrin G sichtbar zu machen.Die Kolokalisation von Ankyrin-G- und Actin-Ringen wurde im Axon-Anfangssegment unter Verwendung eines Kolokalisierungsanalyseverfahrens getestet, um den Pearson-Korrelationskoeffizienten zu berechnen. Der Pearson-Korrelationskoeffizient für die Kolokalisation der Fluoreszenz von Ankyrin G und Aktinringen betrug 0,36 plus oder minus 0,03.
Es ist wichtig, das richtige Tauchöl zu verwenden und die Laserleistung und Belichtungszeit so einzustellen, dass die Gitterlinien sichtbar sind. Sobald festgestellt wurde, dass Protein Teil des periodischen Membranskeletts ist, kann seine Funktion bei der Aufrechterhaltung des periodischen Membranskeletts untersucht und festgestellt werden. Zum Beispiel können die Auswirkungen des Abschlagens des Proteins auf Aktinringe analysiert werden.
Die Entwicklung von hochauflösenden Mikroskopietechniken ist der Grund, warum wir wissen, dass das Axon-Anfangssegment ein periodisches Membranskelett enthält, das aus Aktinringen, Spektrum und Ankyrin besteht. SIM hat es Forschern ermöglicht, periodische Skelettkomponenten der Membran einfach zu visualisieren und Aktinringe in lebenden Zellen zu betrachten.
