Los reguladores positivos permiten que una célula avance a través de los puntos de control del ciclo celular. Los reguladores negativos tienen un papel igualmente importante, ya que terminan la progresión de una célula a través del ciclo celular (o la pausan) hasta que la celda cumpla con criterios específicos.

Tres de los reguladores negativos mejor entendidos son p53, p21 y proteína de retinoblastoma (Rb). Las funciones reguladoras de cada una de estas proteínas se descubrieron después de que se encontraran copias defectuosas en células con replicación incontrolada (es decir, cáncer). Estas proteínas ejercen la mayoría de sus efectos reguladores en el punto de control G₁ al principio del ciclo celular.

P53 influye fuertemente en el compromiso de una célula de dividir. Responde al daño del ADN descontinuando el ciclo celular e invocando enzimas para reparar el daño. Si el daño del ADN es irreparable, p53 puede evitar que la célula continúe a través del ciclo celular induciendo apoptosis, o la muerte celular.

Un aumento en p53 desencadena la producción de p21. P21 evita que la célula pase de la fase G₁ a la fase S del ciclo celular mediante la unión a complejos CDK/ciclina, inhibiendo sus acciones regulatorias positivas.

Rb regula negativamente el ciclo celular actuando sobre diferentes reguladores positivos, principalmente en respuesta al tamaño de la célula. Rb activo (defosforilado) se une a los factores de transcripción, impidiéndoles iniciar la transcripción genética y, por lo tanto, la producción de proteínas.

Cuando Rb está unido al factor de transcripción E2F, inhibe la síntesis de proteínas necesarias para la transición de la fase G₁ a la fase S. A medida que la célula se hace más grande, Rb se fosforila gradualmente hasta que se desactiva y se separa de E2F. E2F puede entonces activar genes que producen las proteínas necesarias para pasar a la siguiente etapa del ciclo celular.