Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Resumen

Aquí se demuestra la microinyección citoplasmática de Xenopus laevis Ovocitos con un sustrato de importación nuclear, así como la preparación de los ovocitos inyectados para la visualización por microscopía electrónica de corte fino.

Resumen

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis seguido por el corte fino de microscopía electrónica (EM) es un excelente sistema para estudiar el transporte nucleocytoplasmic. Debido a su gran núcleo de alta densidad y de los complejos de poro nuclear (CPN), el transporte nuclear puede verse fácilmente en el ovocito de Xenopus. Mucho conocimiento de los mecanismos de importación y exportación nuclear se ha ganado a través del uso de este sistema (revisado por Pante, 2006). Además, hemos utilizado la microinyección de ovocitos de Xenopus a diseccionar las vías de importación nuclear de varios virus que se replican en el núcleo principal.

Aquí se demuestra la microinyección citoplasmática de los ovocitos de Xenopus con un sustrato de importación nuclear. También muestran la preparación de los ovocitos inyectados para la visualización de corte fino EM, incluyendo la disección, la deshidratación, y la incorporación de los ovocitos en una resina epoxi incrustación. Por último, se ofrecen los resultados representativos de los ovocitos que se han microinyección con la cápside del nucleopoliedrovirus baculovirus Autographa californica (AcMNPV) o el virus del parvovirus Minuto de ratones (MVM), y discutir las posibles aplicaciones de la técnica.

Protocolo

Parte 1: Preparación de los ovocitos de Xenopus para la microinyección

1. Coloque una pequeña porción (alrededor de 2 cm) de Xenopus ovario laevis en un tubo cónico de 50 ml que contienen 20 ml de solución de colagenasa (5 mg / ml de colagenasa en calcio sin modificar Barth salina: 88 mM de NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO _4, 10 mM Hepes, pH 7,5). Colagenasa se utiliza para eliminar las células del folículo que rodean a los ovocitos.
2. Coloque el tubo en una plataforma de agitación y el rock con suavidad (a 100 rpm) durante una hora. Este tiempo varía con los diferentes lotes de la colagenasa. Así, después de una hora, tomar una pequeña muestra de los ovocitos y examinarlas bajo un microscopio de disección. Adecuadamente de-folliculated ovocitos deben estar bien separados unos de otros, y debe ser fácil de insertar una aguja de vidrio en el oocito. Si los óvulos no son lo suficientemente de-folliculated, se quedan en la solución de colagenasa y comprueba de nuevo cada cinco minutos.
3. Lavado de los ovocitos tres veces con solución salina modificada de Barth (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM _MgSO4, 0,33 mM Ca (NO _{3) 2,} 0,41 mM CaCl _2, 10 mM Hepes, pH 7,5), y la transferencia de los a 100 mm de diámetro del plato de Petri que contiene MBS más el 1% de penicilina estreptomicina /. Los ovocitos están listos para ser microinyección. Si microinyección se llevará a cabo en otro día, tienda de los ovocitos a 4 ° C durante un máximo de una semana.
4. Utilizando un microscopio de disección, seleccionar ovocitos maduros VI etapa para la microinyección. Estos ovocitos son grandes, con buen contraste entre el hemisferio negro de origen animal y vegetal del hemisferio color crema.
5. La transferencia de los ovocitos maduros etapa VI en una placa de microtitulación (Nunc, un volumen de 10 l bien). Esto debe hacerse con cuidado, usando una pipeta de 200 ml con una pipeta de punta que se ha cortado al final para permitir la succión ininterrumpido de los ovocitos.

Parte 2: La microinyección de ovocitos de Xenopus

1. Prepare el sustrato de importación que se microinyección mediante la adición de una pequeña cantidad de 1% de azul de bromofenol, para ayudar en la visualización de la microinyección. Por ejemplo, podemos añadir 1 l de azul de bromofenol y 10 l de sustrato.
2. Coloque una pequeña tira de Parafilm en una de 100 mm diámetro del plato de Petri, y prescindir de una caída del 5-l de la solución que se inyecta en la tira de Parafilm.
3. Llene una aguja de inyección previamente calibrado (que se obtiene tirando de un 6,6 l micropipeta Drummond con el Inyectar + Matic asistente de cámara) con la solución a inyectar. Para ello, el microinyector se encuentra en el modo de aspiración. Para calibrar la aguja que marca puntos en la aguja cada 0,5 mm, que corresponden a un volumen de 50 nl.
4. Para la inyección citoplasmática, inserte la punta de la aguja en un ovocito en el hemisferio vegetal, muy cerca del hemisferio animal, en un ángulo de aproximadamente 45 grados. A su vez la creación de microinyector microinject y microinject cada ovocito con 50 nl de sustrato de importación. Las marcas de puntos en la aguja se utilizan para controlar la cantidad de sustrato que se ha inyectado.
5. La transferencia de los óvulos inyectados a un pequeño (35 mm de diámetro) una placa de Petri llena de MBS, e incubar a temperatura ambiente durante el tiempo deseado (puntos de tiempo se eligen con el fin de permitir la observación del sustrato de importación asociados con los NPCs, lo que ocurre entre 10 y 30 minutos para las proteínas y los virus que son transportados activamente a la Asamblea Popular Nacional, esta vez también depende del sitio de la inyección y el tamaño de la proteína / virus).
6. Cuando la incubación, la transferencia de ovocitos a un vial de vidrio de 4 ml que contiene 2% de glutaraldehído en el MBS y la solución de la noche a 4 ° C.

Parte 3: Disección de los ovocitos de Xenopus

1. Al día siguiente, lave los ovocitos 3 veces con MBS.
2. La transferencia de ovocitos a una pequeña placa de Petri llenas de sal de amortiguación bajo (LSB: 1 mM KCl, 0,5 mM _MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,5). El uso de un microscopio de disección y pinzas de disección, retirar el polo vegetal de cada ovocito. Es útil para estabilizar el ovocito se analizó con un par de pinzas, mientras que el otro par se utiliza como tijeras para cortar el polo vegetal. En este punto es posible evaluar el éxito de la microinyección por la presencia de un tinte azul en el citosol. El protocolo se mantendrán solamente por los ovocitos que se microinyección con éxito. Además, si las muestras se prepararán para EM, este paso disección hace que sea mucho más fácil encontrar el núcleo cuando se poda y el corte de las muestras.
3. Fijar los ovocitos disecados de nuevo con glutaraldehído al 2% en LSB durante una hora a temperatura ambiente.
4. Después de la fijación, lavado de los ovocitos diseccionado en tres ocasiones con la LSB.

Parte 4: Preparación de los ovocitos inyectados para la Incorporación de EM y delgada de seccionamiento

1. La transferencia de los ovocitos disecados a una diapositiva depresión. Aspirar la mayor cantidad de líquido como seaposible, y luego rápidamente (para que no se sequen) cubren los ovocitos analizó con bajo punto de fusión agarosa al 2%. Mientras que la agarosa es todavía suave, use una punta de pipeta para separar los ovocitos de los demás, y para asegurarse de que cada ovocito está boca arriba o hacia abajo (no hacia los lados).
2. Deje que la agarosa para solidificar durante unos 10 minutos. Una vez que la agarosa se solidifica, use una hoja de afeitar para cortar la agarosa en trozos pequeños, cada uno con un ovocito disecados.
3. Coloque los ovocitos de agarosa incrustado en un frasco de vidrio de 4 ml, y los post-solución con un 1% OsO ₄ en LSB durante una hora a temperatura ambiente.
4. Lavar la muestra tres veces en la LSB. Si es necesario, guardar la muestra a 4 ° C durante la noche y continuar con el protocolo al día siguiente.
5. Secuencialmente deshidratar las muestras en una serie ascendente de alcohol (50, 70 y 90% de etanol durante 20 minutos cada uno). Esto es seguido por dos cambios en el 100% de etanol durante 15 minutos cada uno. Finalmente se deshidratan las muestras con acetona al 100% durante 15 min.
6. Infiltrarse en las muestras con una mezcla de 1:1 de Epon (Fluka) y acetona durante una hora, seguido por la infiltración con una mezcla de 2:1 de Epon y acetona durante dos horas, y finalmente en pura Epon por lo menos seis horas.
7. Colocar las muestras en moldes incorporación plana llena de frescos Epon puro. Los ovocitos están orientadas de tal forma que el lado del núcleo más cercano al lugar de la inyección - en este caso del lado de los ovocitos que se ha dividido - serán distribuidos en primer lugar. Este paso sirve para optimizar las posibilidades de visualización de las importaciones del sustrato elegido.
8. Por último, polimerizar el Epon durante dos días a 60 ° C.
9. Con el fin de visualizar las muestras, los bloques se cortan y se secciona a continuación, utilizando una ultramicrotomo. Las secciones son transferidos a las redes de EM, teñidas utilizando el procedimiento estándar, y se visualizaron con un microscopio electrónico de transmisión. No vamos a mostrar esta parte del protocolo, ya que es el procedimiento estándar de EM.

Parte 5: Resultados del representante:

Si el protocolo ha sido un éxito, entonces la envoltura nuclear (NE) y el CPN debe ser claramente visible en micrografías EM. Dependiendo de la inyección del sustrato y la cantidad de tiempo entre la inyección y la fijación, el sustrato debe ser visible en la cara citoplásmica de la APN, en la Asamblea Popular Nacional, o en el frente nuclear de la APN.

La figura 1 muestra una sección transversal NE con citoplasma adyacente (c) y el núcleo (n) a partir de un ovocito de Xenopus que ha sido inyectado con cápsides de los baculovirus AcMNPV, se incubaron a 4 ° C durante cuatro horas, y se procesaron para inclusión y corte delgado EM como se describe. Puntas de flecha a punto de NPCs. Un acoplamiento cápside en la cara citoplásmica de un NPC se indica con una flecha blanca.

En contraste, la figura 2 muestra una sección transversal NE con citoplasma adyacente (c) y el núcleo (n) a partir de un ovocito de Xenopus que ha sido inyectado con el virus de parvovirus Minuto de ratones (MVM), incubados a temperatura ambiente durante cuatro horas, y procesados ​​para inclusión y la sección delgada EM como se describe. Usando esta técnica, hemos encontrado que MVM induce alteraciones de la NE (Cohen y Pante, 2005). Paréntesis indican los saltos en el NE. Puntas de flecha a punto de NPCs. Cápsides putativo MVM asociado con la NE se indican con flechas blancas.

Figura 1: Micrografía electrónica de una sección NE con citoplasma adyacente (c) y el núcleo (n) a partir de un ovocito de Xenopus que ha sido inyectado con cápsides de los baculovirus Ac MNPV, se incubaron a 4 ° C durante cuatro horas, y se procesaron para incorporación de la sección delgada y EM como se describe. Puntas de flecha a punto de NPCs. Cápsides se indican con flechas blancas. Barra de escala: 100 nm.

Figura 2: Micrografía electrónica de una sección NE con citoplasma adyacente (c) y el núcleo (n) a partir de un ovocito de Xenopus que ha sido inyectado con el virus de parvovirus Minuto de ratones (MVM), incubados a temperatura ambiente durante cuatro horas, y procesados ​​para inclusión y la sección delgada EM como se describe. Puntas de flecha a punto de NPCs. Paréntesis indican los saltos en el NE. Cápsides putativo MVM asociado con la NE se indican con flechas blancas. Barra de escala: 100 nm.

Discusión

Microinyección de ovocitos de Xenopus combinado con finas corte EM es una herramienta muy eficaz para el estudio de transporte nucleocytoplasmic. Este sistema ha sido utilizado para asignar los distintos pasos de la importación a través de la APN, por ejemplo de interacción de un sustrato de importación nuclear con componentes estructurales de la APN, tales como los filamentos de citoplasma y una canasta nuclear (revisado por Pante, 2006). También se ha utilizado para estudiar la importación nuclear de l...