Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

Resumen

Se describen las características estructurales de la sinapsis neuromuscular Glia-en una nueva preparación de tejidos de adentro hacia afuera de las larvas de mosca en directo con tintes fluorescentes con microscopía confocal. Hemos marcado terminales de las neuronas en vivo con anticuerpos fluorescentes primaria de HRP, y también se visualiza el espacio perisynaptic con dextranos fluorescentes.

Resumen

Nuestro proyecto identificó GFP etiquetados estructuras gliales en la mosca en desarrollo larval sinapsis neuromuscular. Para ver el desarrollo de vida de la glía sinapsis nervio-músculo, hemos desarrollado una preparación de tejidos larvarios que tenían características de las larvas intactas en vivo, sino que también tenía buenas propiedades ópticas. Esta nueva preparación también se permitió el acceso de perfusates a la sinapsis. Hemos utilizado larvas de mosca, inmerso en la hemolinfa artificial, y se relajó sus contracciones rítmicas normales del cuerpo por el frío ellos. A continuación se diseca los segmentos posteriores de cada animal y con un alfiler de insectos contundente empujó la partes de la boca hacia atrás a través de la cavidad del cuerpo. Esta eversión de la pared cuerpo de la larva, como convertir un calcetín del revés. Hemos completado la disección con tijeras de disección ultra-fino y por lo tanto expuesto el lado visceral de los músculos de la pared del cuerpo. Las estructuras gliales en la UNM expresa GFP membrana dirigidos bajo el control de promotores específicos gliales. La membrana post-sináptica, la República Socialista Soviética (Reticula subsináptica) en el músculo expresado sinápticamente objetivo dsRed. Necesitábamos etiqueta agudamente la terminales de las neuronas motoras, la tercera parte de la sinapsis. Para ello se aplicaron anticuerpos primarios a HRP, conjugado con una emisión flurophore rojo lejano. Para probar las propiedades de la difusión de color en el espacio perisynaptic entre los terminales de las neuronas motoras y la SSR, se aplicó una solución de grandes moléculas de dextrano conjugado con flurophore emitiendo ahora de color rojo y las imágenes recogidas.

Protocolo

Parte 1: Preparación del tejido

1. Nuestro objetivo es una preparación de tejidos de larvas de mosca en el sistema nervioso está intacto, pero la superficie interior de la pared muscular del cuerpo se expone a una hemolinfa artificial, y se pueden colocar cerca de un cubreobjetos microscopio para ópticas. En otras palabras, un interior a cabo la preparación de larvas.
   
   Dado que las preparaciones convencionales de tejidos se refieren al corte, fijación y estiramiento de la pared muscular del cuerpo, ya veces la eliminación de parte del sistema nervioso, necesitamos un enfoque diferente.
   
   Queríamos que los animales de dentro a fuera porque quería conseguir un buen vistazo a las características estructurales y los cambios estructurales en el tiempo en la sinapsis, y hemos querido mantener el sistema nervioso intacto. También hemos querido evitar el estiramiento del tejido, y la activación de los receptores de estiramiento, lo que haría que los músculos de contracción y la ruina de nuestras imágenes.


2. Para empezar, el estadio de los animales. La alimentación de las larvas de tercer y errante larvas de tercera son grandes y fáciles de diseccionar lo que vamos a demostrar en W3 larvas. Este animal se tiene el fenotipo Tubby, y es muy amplia, por lo que es fácil de Evert.
   
   Hemos utilizado las larvas que vimos activamente gatear, incluyendo larvas de W3.
3. Limpie la superficie de un gusano con un pincel muy suave en una placa de Petri de H2O bidestilada. Las larvas tienen una mejor óptica limpia y la limpieza reduce las bacterias.
4. La transferencia de los animales a una pequeña placa de Petri de alrededor de 3 ml de hielo frío HL-6, y en la hemolinfa artificial. Coloque el plato en el hielo hasta que el animal deja de moverse, y se relaja (unos 5 minutos).
5. Sujete con fórceps punta muy fina en una mano y las tijeras de primavera en el otro. Yo uso las tijeras con la mano dominante. Haz un pequeño agujero en la pared del cuerpo con las tijeras para equlibrate la presión a través de la pared del cuerpo.
6. Sujetar al animal suavemente con las pinzas hacia abajo en la parte inferior de la placa y cortar la parte posterior de dos segmentos. Diseccionar las vísceras y la grasa corporal es probable que se mueven fuera de la cavidad del cuerpo. Cortar este tejido también.
7. Mantenga las larvas contra la parte inferior plato con unas pinzas finas. Mantenga un pin # 0 de insectos en (con punta roma) y empujarla contra la partes de la boca de las larvas. Empuje el aparato bucal a través de la cavidad del cuerpo como el que está girando un calcetín del revés.
8. El revés del tejido se parecerá a la figura: a continuación. Con ultra-fino de herramientas de disección, diseccionar los de grasa corporal y trachioles de la pared del cuerpo. Realmente difícil tratar de no tirar la trachioles, o desconectar el sistema nervioso. Rasga el trachioles rasgar los agujeros en la pared muscular del cuerpo.
   
   Extraer el cuerpo tanta grasa como sea posible. Ambas estructuras alterar la calidad óptica de sus tejidos. Es posible que desee omitir el café antes de hacer esta preparación.


9. Cuando haya terminado el músculo será transparente, no opaco o blanco. Si ponemos la preparación de tejidos en HL-6 sin glutamato, a temperatura ambiente, es probable que se contraen rítmicamente, porque los generadores de patrón motor en el sistema nervioso central están trabajando.
   
   Evite el uso de preparaciones con los músculos contraídos, obviamente, o contratados irregularmente pared del cuerpo.
   
   El interior de la pared del cuerpo intacto fácilmente tiende a doblar por la mitad a lo largo de la línea media dorsal y ventral, por lo que la preparación le da a la izquierda oa la derecha "hemi-animal" para visualizar.
10. 1.9 Montar el tejido, ya sea en una cámara de pequeño volumen comercial, tales como la cámara de Warner, o un portaobjetos de microscopio con una disposición de cubierta antideslizante puente. Ver la parte 3 de sugerencias sobre el tejido de montaje.

Parte 2: Etiquetado de Bouton neuronal con anticuerpos marcados con fluorescencia primaria contra el HRP.

1. Poner 50 microlitros de la etiqueta fluorescente primario anti-cuerpo contra el HRP en HL-6 en una gota en una placa de Petri. Sumergir la preparación del cuerpo de adentro hacia afuera de la pared en el baño de tinte. Usted puede ver el etiquetado neurona terminal después de unos 5 minutos, pero se incuba durante 10-20 minutos, de una etiqueta completa y brillante.
2. Enjuague el tinte fuera durante 10-30 segundos en HL-6 a temperatura ambiente. No obligado tinte enjuaga rápidamente, así que el ciclo de enjuague no es necesario ser agresivo.
3. Variar la concentración de colorante y el tiempo de incubación, según sea necesario.

Parte 3: etiquetado espacio Perisynaptic con dextrano conjugado flurophore

1. Diluir con fluorescencia conjugada con dextrano tintura diluida en HL-6. Una concentración que funcionó bien para nuestros propósitos fue:
2. Si usted no está preocupado por el tiempo de acceso medio de contraste dentro de su espacio extracelular, poner una gota 20 micro litros de colorante en un "puente" cubreobjetos (véase la parte 4) y el depósito de preparación en el baño de tinte.

Parte 4: Montaje del tejido para la visualización (con microscopía confocal).

Si no es necesario para perfundir su preparación (breves observaciones) o si desea mantener el volumen de baño HL-6 pequeños, utilice el método de doble cara en puente

Si desea perfundir su preparación, pruebe a usar una cámara de perfusión. Se utilizó un moCámara dified de instrumentos de Warner.

Detalles para los dos siguientes.

Montaje de preparación en un portaobjetos de doble puente.

1. Use un portaobjetos muy limpio. Superglue dos cuadrados de 18 mm (# 1.5) cubreobjetos sobre el portaobjetos. Deje un espacio de 2 mm entre los bordes del cubreobjetos.
2. Deje que el pegamento seque completamente, o se forma una película extraña en los medios acuosos alrededor de su preparación.
3. Posición de la parte interior de larvas entre los bordes de los cubreobjetos. Es posible que necesite la posición de la preparación en una diagonal, si las larvas es grande y su sistema de adquisición de imágenes tiene una matriz de píxeles limitados.
4. Cubrir el tejido con un cubreobjetos # 1.5 mm, 18 mm (muy limpio). Se adhieren al "top" de la diapositiva colocada cubreobjetos se desliza el tejido de acompañamiento, con vaselina mínimo.
5. Ponga una gota de aceite de Cargill objetivo personalizado con un índice de refracción de 1,3379 (si se utiliza HL-6) en el cubreobjetos encima y voltear esta asamblea otra vez.
6. Coloque el conjunto del tejido en el microscopio de lado el petróleo, hacia el objetivo, y enfocará su objetivo.
   Montaje del tejido en una cámara de perfusión modificado.
7. Pegue un cubreobjetos de 1,5 a formar un piso en la cámara de RC 20. Coloque el tejido en la cámara de acuerdo con las instrucciones de RC-20. Use un pedazo de malla en lugar de Nytex un cubreobjetos para formar un techo de la cámara.

Parte 5: Resultados del representante:

1. De adentro hacia fuera la preparación del tejido disección de la secuencia:
   
   W3 larvas, se lavó ("Tubby" fenotipo) (5.1.1). W3 larvas, posterior dos segmentos disecados. Usted puede ver el cuerpo de grasa empujado fuera de la cavidad del cuerpo por cuerpo trans-presión de la pared (flecha). Trate de minimizar visceral "erupción", haciendo un pequeño agujero en la pared del cuerpo un minuto antes de la disección (5.1.2). La preparación de las vísceras disecados antes de encender la preparación de adentro hacia afuera (5.1.3). La preparación, en su mayoría evertido, con el pasador (flecha) dentro de la luz de la preparación (5.1.4). El músculo se encuentra ahora en el exterior y la cutícula está en el interior, con alguna grasa corporal y trachioles adjunta (5.1.5). Un tejido completamente disecados preparación con casi todos los de la grasa corporal y trachioles disecados (5.1.6).
   
2. Vivir el etiquetado el uso de anti-HRP en la UNM larval. Un representante W3 larval músculos y nervios hacen sinapsis con una extensión gliales (de adentro hacia afuera-prep). Los terminales de las neuronas motoras bouton se etiquetan con un primario anti-cuerpo contra HRP (magenta), que se conjuga con Cy5. Los procesos gliales están etiquetados con las buenas prácticas agrarias (verde).
   
3. Espacio Perisynaptic fluorescencia visualiza con Alexa 680 dextrano en un revés de preparación. El proceso gliales (verde) está marcada con GFP membrana específicos. La República Socialista Soviética de post-sináptica en la superficie del músculo (azul) está marcado con dsRed. El dextrano Alexa (rojo) formas concentra en las zonas extracelular. El tinte de dextrano forma piscinas en forma de anillo en los espacios perisynaptic. El etiquetado de dextrano y SSR dsRed etiqueta se muestra en escala de grises. Tenga en cuenta las piscinas con forma de donut múltiples tinte destacando los espacios perisynaptic (flecha).

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Discusión

Este procedimiento permite a largo plazo de imágenes en vivo de proteínas marcadas y los procesos celulares. La preparación en el tejido in situ que se describe tiene un sistema nervioso central intacto y funcionando, PNS y circuitos reflejos. Esta preparación de tejidos tiene ventajas sobre los protocolos estándar de larvas de mosca de los músculos, donde se estira el músculo de la pared del cuerpo larval (cuando se fija a cabo). El estiramiento puede distorsionar la morfología sináptica y de...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium.	Reagent	N/A	NA	5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma).2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph.References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004
Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	D34680	Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low
Anti-HRP-CY5 conjugate (goat)	Reagent	Jackson ImmunoResearch	123-175-021	Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at –20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6
Alexa 647 antibody labeling kit	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	A10475	We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling.
Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379	Reagent	Cargill Labs	Custom Formulated
Ultra Fine Forceps	Tool	Fine Science Tools	11252-23 or 11295-20
Spring scissors	Tool	Fine Science Tools	91500-09
Ultra fine clipper scissors	Tool	Fine Science Tools	15200-00
Perfusion Chamber RC 20 Series	Tool	Warner Instruments	64-02222
Spinning Disc confocal	Microscope	Quorum Technologies	Quorum Wave FX	Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope