No radiactivo In situ La hibridación aplicable para el abeto rojo protocolo y una serie de especies de plantas

Resumen

Se describe una modificación DIG In situ Protocolo de hibridación, que es rápido y es aplicable en una amplia gama de especies de plantas como el abeto rojo. Con sólo unos pocos ajustes, incluyendo el tratamiento altera la concentración de RNasa y proteinasa K, el protocolo puede ser utilizado en los estudios de los diferentes tejidos y especies.

Resumen

Las tecnologías de la expresión de alto rendimiento de análisis disponibles en la actualidad a los científicos un desbordamiento de perfiles de expresión, pero su solución en términos de expresión específica de tejido es limitado debido a problemas en la disección de los distintos tejidos. Los datos de expresión tiene que ser confirmada y completada con los patrones de expresión utilizando por ejemplo la hibridación in situ, una técnica utilizada para localizar la expresión de ARNm de células específicas. El método de hibridación in situ es laboriosa, consume tiempo y requiere a menudo una amplia optimización dependiendo de la especie y el tejido. En experimentos in situ son relativamente más difíciles de realizar en las especies leñosas, como el abeto de coníferas de Noruega (Picea abies). Aquí les presentamos una modificación en el protocolo DIG hibridación in situ, que es rápido y es aplicable en una amplia gama de especies de plantas incluyendo P. abies. Con sólo unos pocos ajustes, incluyendo el tratamiento altera la concentración de RNasa y proteinasa K, se podría utilizar el protocolo de estudio de la expresión específica de tejido de genes homólogos en los órganos reproductivos masculinos de una gimnospermas y dos especies de angiospermas, P. abies, Arabidopsis thaliana y Brassica napus. El protocolo funcionó igual de bien para las especies y los genes estudiados. AtAP3 y BnAP3 se observaron en el segundo y tercer verticilo órganos florales en A. thaliana y B. napus y DAL13 en microsporophylls de conos masculinos de P. abies. Por P. abies la concentración de proteinasa K, que se utiliza para permeablize los tejidos, tuvo que ser aumentada a 3 g / ml en lugar de 1 g / ml, posiblemente debido a los tejidos más compactos y más altos niveles de compuestos fenólicos y polisacáridos. Para todas las especies el tratamiento RNasa fue retirado debido a la reducida fuerza de la señal sin el correspondiente aumento de la especificidad. Al comparar los patrones de tejidos específicos de la expresión de genes homólogos de las plantas con flores como de un árbol de coníferas nos demuestran que la DIG en el protocolo situ que aquí se presenta, con sólo pequeños ajustes, se puede aplicar a una amplia gama de especies de plantas. Por lo tanto, el protocolo evita tanto la optimización de las especies extensa específicos y el uso de sondas laborioso marcado radiactivamente a favor de las sondas DIG etiquetados. Hemos elegido para ilustrar los pasos técnicamente exigentes del protocolo en nuestra película.

Anna Karlgren y Carlsson Jenny contribuyeron igualmente a este estudio.

Con los autores: Anna Karlgren en Anna.Karlgren @ ebc.uu.se y Sundström Jens F. en Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

Protocolo

Este ARNm no radiactivos en el protocolo de hibridación in situ se ha optimizado para Noruega tejidos abeto y describió en detalle. Se basa en un Arabidopsis / colza en el protocolo de hibridación in situ optimizado en nuestros grupos, que a su vez se basa en los protocolos de la Meyerowitz y laboratorios irlandeses y optimizado por Vivian irlandés, Lincoln Cindy y largo Jeff entre otros ^1-4.

PROCEDIMIENTO

1. Fijación e inclusión

Para proporcionar tejidos de ARN de retención deben ser fijadas y embebidas en cera antes de que en el experimento se lleva a cabo in situ. La fijación e inclusión es un paso crítico ya que los materiales mal fijo podría dar una señal de baja o no detectable a pesar de que el ARNm es muy abundante. Los tejidos se deshidratan, se aclaró y embebidos en cera en los cambios graduales para evitar daños en los tejidos. Para evitar una mayor contracción y la hinchazón de las células se añade NaCl al 0,85% de los pasos de etanol por primera vez en la deshidratación de los tejidos de abeto de Noruega. Es posible dejar de lado el NaCl en el etanol (por ejemplo, se deja en el protocolo de Arabidopsis / colza). La etapa de deshidratación durante la incrustación se puede realizar en el hielo para mantener la actividad RNasa, como mínimo, o en el 4 ° C. En este protocolo la solución de paraformaldehído al 4% solución contiene 0,25% de glutaraldehído, que se supone que para dar una mejor retención de ARN a pesar de que algunos sostienen que es probable que no hace ninguna diferencia (por ejemplo, se deja en el protocolo de Arabidopsis / colza). Lo más probable es toda fijación estándar y el protocolo de incorporación se puede utilizar. Como se ve por debajo de la incorporación de abeto rojo difiere ligeramente del protocolo de Arabidopsis / colza.

1.1 Día 1 Recogida de material vegetal y la fijación de paraformaldehído

1. Recoger el material vegetal de interés y analizar si es necesario. Mantener los tejidos en el hielo y colocarlos en una solución de fijar helada (ver recetas abajo), directa o tan pronto como sea posible. NB! Mantener en hielo todo el tiempo!
2. Aplicar un vacío de las muestras hasta que el paraformaldehído comience a burbujear. Mantener el vacío durante un máximo de tres horas (por ejemplo, 2 x 15 min de Arabidopsis y tejidos florales de colza o de una hora para Noruega conos de pino macho) y liberar el vacío lentamente. Los tejidos se supone a hundirse después de la infiltración de vacío del fijador, pero para ciertos tejidos que contienen una gran cantidad de aire que no es posible (por ejemplo, flores Arabidopsis). Un trozo de gasa puede ser utilizado para hacer los tejidos estancia en el fijador.
3. Vuelva a colocar el fijador y se incuba a 4 ° C durante la noche (~ 16.12 horas) agitando suavemente.

Opción 1

NB! Abeto rojo versión incorporación a continuación (pasos 4-8). Hacer que los tubos de centelleo o frascos de vidrio se utilizan, por lo menos en el paso 5.

1.2 Día 2 deshidratación NB! Abeto rojo versión de incrustación.

4. 0,85% de NaCl	30 min	con hielo
   50% EtOH + 0,85% de NaCl	90 min	con hielo
   EtOH al 70% + 0,85% de NaCl	90 min	con hielo

   Haga una pausa! Es posible que parar aquí y almacenar los tejidos en un 70% EtOH + NaCl al 0,85% en 4 ° C durante varios meses.

   85% EtOH + 0,85% de NaCl	90 min	4 ° C
   EtOH al 95% (+ eosina)	90 min	4 ° C

   NB! Eosina se añade a las manchas de los tejidos de color rosa lo que facilita su detección durante la inclusión y corte, pero puede ser excluida.

   EtOH al 100% (+ eosina)	90 min	4 ° C
   EtOH al 100% (+ eosina)	durante la noche	4 ° C

1.3 Día 3 La deshidratación y la incrustación de NB! Abeto rojo versión de incrustación.

1. EtOH al 100% (+ eosina)	2 h	a temperatura ambiente
   50% + 50% EtOH Histoclear II	1 h	a temperatura ambiente
   100% Histoclear II	1 h	a temperatura ambiente
   100% Histoclear II	1 h	a temperatura ambiente
   50% Histoclear II + 50% Histowax	durante la noche	40-50 ° C

   NB! En el último paso de la concentración de Histowax no es crucial, sólo vierte en algunos chips de cera.

1.4 Día 4 Incorporación de NB! Abeto rojo versión de incrustación.

6. 100% derretida Histowax

   60 ° C

   (Cambiar la mañana y noche)

1.5 Día 5 Incorporación de NB! Abeto rojo versión de incrustación.

7. 100% derretida Histowax

   60 ° C

   (Cambiar la mañana y noche)

1.6 Día 6 Integración NB! Abeto rojo versión de incrustación.

8. 100% derretida Histowax

   60 ° C

   (Cambiar la mañana y noche)

   NB! Esta bien, si la cera de vez en cuando se cambia una vez al día, pero luego se necesitan dos días para completar un día de cambios. El cambio de cera también se puede continuar por dos días más sin ningún problema. Esto se recomienda para muestras grandes, ya que ayuda a la infiltración de la cera en el centro de estos tejidos.

Opción 2

NB! Arabidopsis / colza incorporación de la versión siguiente (pasos 4-8).

1.2 Día 2 deshidratación NB! Arabidopsis / versión de colza incrustación.

4. NB! Todos los pasos a 4 ° C y agitando suavemente, si no se indica otra cosa.

   1x PBS	30 min
   1x PBS	30 min
   30% de EtOH	60 min
   40% EtOH	60 min
   50% de EtOH	60 min
   60% de EtOH	60 min
   EtOH al 70%	60 min

   Haga una pausa! Es posible que parar aquí y almacenar los tejidos en un 70% EtOH a 4 ° C durante varios meses.

   85% de EtOH	60 min
   EtOH al 95% (+ eosina)	durante la noche

   NB! Eosina se añade a las manchas de los tejidos de color rosa lo que facilita su detección durante la inclusión y corte, pero puede ser excluida.

1.3 Día 3 deshidratación y embeddING NB! Arabidopsis / versión de colza incrustación.

5. NB! Todas las medidas a temperatura ambiente y agitando suavemente, si no se indica otra cosa.

   EtOH al 100% (+ eosina)	30 min
   EtOH al 100% (+ eosina)	30 min
   EtOH al 100% (+ eosina)	60 min
   EtOH al 100% (+ eosina)	60 min

   NB! La transferencia de los tejidos a viales de centelleo o viales (vidrio).

   75% + 25% EtOH Histoclear II	30 min
   50% + 50% EtOH Histoclear II	30 min
   25% + 75% EtOH Histoclear II	30 min
   100% Histoclear II	60 min
   100% Histoclear II	60 min
   100% Histoclear II + ¼ volúmenes de chips Histowax	durante la noche (no sacudir)

   NB! En el último paso de la concentración de Histowax no es crucial, sólo vierte en algunos chips de cera.

1.4 Día 4 Incorporación de NB! Arabidopsis / versión de colza incrustación.

6. Colocar los viales con los tejidos a 42 ° C hasta que las virutas de cera derretirse por completo. A continuación, agregue ¼ volumen de chips de cera y dejar que derrita completamente. Mover a +60 ° C y dejar los viales durante varias horas. Finalmente, vuelva a colocar la cera / II Histoclear con cera derretida y recién se incuban durante la noche a 60 ° C.

1.5 Día 5 Incorporación de NB! Arabidopsis / versión de colza incrustación.

7. 100% derretida Histowax

   60 ° C

   (Cambiar la mañana y noche)

1.6 Día 6 Integración NB! Arabidopsis / versión de colza incrustación.

8. 100% derretida Histowax

   60 ° C

   (Cambiar la mañana y noche)

   NB! En el protocolo de Arabidopsis / colza (en comparación con el protocolo de abeto rojo) no es un Día 7 incrustación de la misma manera como en los días 5-6, es decir, 100% Histowax funde a 60 ° C y el cambio por la mañana y por la tarde
   NB! Esta bien, si la cera de vez en cuando se cambia una vez al día, pero luego se necesitan dos días para completar un día de cambios. El cambio de cera también se puede continuar por dos días más sin ningún problema. Esto se recomienda para muestras grandes, ya que ayuda a la infiltración de la cera en el centro de estos tejidos.

1.7 Día 7 incrustación de objetos (el día 8 en el protocolo de Arabidopsis / colza) (Film! Los detalles técnicos se muestra en la película)

9. Precaliente placas de Petri y / o moldes a +60 ° C. A su vez en una placa caliente (60 ° C) y asegúrese de Histowax derretida está disponible.
10. Vierta los tejidos y Histowax se fundió en una placa de Petri (o un molde) colocado en el plato caliente. Añadir más Histowax modo que los tejidos están cubiertos. Calentar un par de pinzas y distribución de los tejidos de manera uniforme en el plato. Llene la caja de Petri (o molde). Si la cera se endurece antes de que los tejidos están en la posición correcta, se calienta de nuevo o eliminar la cera endurecida con el par de pinzas se calienta.
11. Dejar que la cera de bloques se endurecen a temperatura ambiente antes de colocarlos en el 4 ° C. Es mejor hacer varios bloques de cera en lugar de incrustar los tejidos con demasiada fuerza ya que el bloque de cera puede rajarse cuando las piezas se cortan durante el corte.
    Haga una pausa! Almacenar a 4 ygrados; C. Los tejidos son estables durante años.
    NB! Trabajo RNasa libre de este paso y en adelante. Use guantes, DEPC tratar MilliQ de agua, tampones, cristalería, etc, tampones autoclave y horno de vidrio, etc, cuando proceda.

2. Seccionamiento (detalles Film! Técnico se muestran en la película)

12. A su vez en dos platos calientes (60 ° C y +42 ° C) y asegúrese de Histowax derretida está disponible.
13. Calentar un bisturí y corte cuidadosamente un bloque de cera de tejido de la placa de Petri (que podría romperse si uno es demasiado violento), o quitarlo del molde. Cuando un bloque de cera solo se ha separado, la forma de la pieza en el tamaño y la forma de facilitar el corte en el microtomo.
14. La pieza de cera debe tener una cera extra "talón", debajo del tejido para que pueda ser conectada a la titular del bloque. Calentar el titular de bloque y el talón en la placa caliente (60 ° C) y fusionarlas. Podría ser necesario que se ponga una gota de Histowax II para hacer la fusión estable. Deje que se endurezca en el 4 ° C.
15. Cortar el bloque de cera en secciones de 6-8 micras de espesor conectados en una larga cinta utilizando un microtomo.
    NB! Esto será más fácil si el bloque de cera es la cámara fría, es decir, el bloque de cera en el 4 ° C y llevarlo a la nevera al iniciar el corte. También puede ser beneficioso para mantener el frío cuchillo.
16. Estudio de las cintas de las secciones de una lupa y marca los que se utilizarán.
17. Ponga RNasa libre MilliQ de agua en las diapositivas (Probe-On Plus de Fisher Biotecnología, que se pre-limpiado y cargado). Corte la cinta en trozos más pequeños y los puso ("back" o el lado "brillante" hacia abajo) en las diapositivas. Las diapositivas con las cintas deben ser colocados en una placa de +42 ° C. La cinta debe aplanar (esto es importante!) En el agua. Que las secciones sentarse durante unos minutos y luego usar un papel Kimwipe / tejido para drenaje del agua.
18. Deje los portaobjetos en la placa durante 1-2 horas.
19. Incubación los portaobjetos en 42 ° C durante la noche para que los tejidos se adhieran a las diapositivas.
    Haga una pausa! Se recomienda el uso de las secciones lo más pronto posible, pero se pueden almacenar en seco en cajas cerradas con desecante hasta varios días a 4 ° C.

3. LA TOMA DE LAS SONDAS

La hibridación in situ detecta expresión utilizando una sonda específica marcada por un determinado ARNm. La sonda, que suele ser un trozo de ARN complementarias, pueden ser marcadas con digoxigenina, DIG. DIG es una molécula pequeña, que se puede conectar a la uridina y por lo tanto incorporado en la sonda de ARN y luego detectados utilizando DIG anticuerpos específicos.

El diseño y la fabricación de la sonda es el paso más crítico en un ARN en el experimento de hibridación in situ. Se debe tener cuidado para asegurarse de que la sonda tiene una alta especificidad y se etiqueta con UTPs de alta calidad. A veces la temperatura de hibridación y / o la longitud de la reacción tiene que ser ajustado para las sondas específicas. Como siempre, se debe tener cuidado para evitar la contaminación de RNasa.

Antes de etiquetado, aislar a una plantilla de acuerdo a sus protocolos estándar, por ejemplo, uso clones cDNA, PCR fragmentos, y alinear la plantilla. Fragmentos de sentido y antisentido son aislados y amplificados a partir de la plantilla con primers específicos de genes. De fragmentos de amplificación de PCR no utilizan las enzimas que producen salientes 3 '. Para todos los fragmentos de un T7 (o SP6 o T3) saliente se agrega utilizando los cebadores que lleva el T7-secuencia o el uso de un vector con un promotor T7-.

El sentido (ARNm o (- cadena)) de la sonda tiene la misma secuencia que el ARNm de destino y no se hibridan con el ARNm diana, mientras que el antisentido (anti-ARNm o (+) hebra) de la sonda que la secuencia complementaria y por lo tanto se hibridan con el objetivo de dar la señal de interés. La sonda de sentido se utiliza como control negativo y no hay señal se obtendrá si el experimento funcionaba correctamente. Un control positivo también es necesaria, por ejemplo, una sonda que detecta un gen mantenimiento de la casa. La mayoría de las diapositivas debe ser hibridado con las sondas antisentido, mientras que sólo unas cuantas diapositivas debe ser hibridado con las sondas de control diferentes.

3.1 Sonda de etiquetado utilizando Transcripción in vitro

Los reactivos de la DIG RNA Etiquetado Kit (SP6/T7, 11175025910, Roche Ciencias Aplicadas, Mannheim, Alemania) o similares se utilizan al etiquetar las sondas. La reacción de 20 l se describe aquí debería producir unos 10 g de ARN marcada con DIG.

20. Hacer una transcripción in vitro para incorporar nucleótidos marcados. Añadir los siguientes reactivos a un tubo (mantener en hielo):

    Ingrediente	volumen / cantidad
    10 x NTP mezcla de etiquetado	2 l
    10 x tampón de transcripción	2 l
    Protector de inhibidor de RNasa	1 l (20U)
    ARN polimerasa T7 (SP6 o T3)	2 l
    Plantilla de ADN (500-1000 ng)	x l
    RNasa libre MilliQ de agua	l y, hasta un volumen final de 18 l

21. Mezclar la mezcla de etiquetado NTP, tampón de transcripción, inhibidor de RNasa (NB! si la sonda es corto, por ejemplo, <500bp, usted puede aumentar la concentración de inhibidor de RNasa de 40U), de la polimerasa de ADN molde y el agua y centrifugar brevemente.
22. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 2 horas (NB! si la sonda es corto, por ejemplo, <500bp, aumentar el tiempo de reacción a 06.04 horas).
23. Añadir 2 l de DNasa I y se incuba a 37 ° C durante 15 min.
24. Detener la reacción añadiendo 2 l 0,2 M EDTA (pH 8,0). Compruebe el producto en gel.
25. Precipitar la sonda mediante la adición de 2,5 l de 4 M LiCl y 75 l de etanol> 99,5%. Mezclar bien e incubar a -20 ° C durante la noche (NB! No utilice tRNA como portador. En lugar de utilizar el glucógeno o de acrilamida según los fabricantes).
26. Centrífuga (13 000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C y retirar el sobrenadante. Lavar el sedimento (por lo menos 10 min 13 000 rpm) dos veces en el 70% de etanol (~ 150 a 300 l).
27. Eliminar el sobrenadante y dejar que el pellet seco. Resuspender la sonda en 30 l de RNasa libre de agua durante 1-2 horas en el hielo.
    Haga una pausa! La sonda puede ser almacenado a -20 ° C durante más de un año.
    NB! Guardar muestras de 0,5 l en el paso 21 (antes de la transcripción in vitro), el paso 23 (antes del tratamiento con DNasa), el paso 24 (después del tratamiento con DNasa, pero antes de la precipitación) y una muestra de l a partir del paso 27 (cuando la sonda se ha resuspendido). Ejecutar las muestras en un gel de nondenaturating TBE 1%. Si la reacción DNasa ha funcionado correctamente en la plantilla de banda va a desaparecer. La transcripción in vitro debería generar una gruesa banda de RNA de aproximadamente el tamaño correcto. Si ves a múltiples bandas, denaturate las muestras a 80 ° C durante 5 minutos, seguido de enfriamiento en hielo antes de la carga. Si la recuperación desde el paso 27 se ve mal que podría ser así porque la sonda no se volvió a suspender también. Incubar el ARN a +55 ° C 50-10 minutos para llegar a una solución.

3.2 La hidrólisis de las sondas de largo

NB! Si la sonda es mayor de 150 pb que se debe reducir a 50-150 pb para dar una señal de alto, debido a una mejor penetración. La sonda puede ser químicamente degradados en un tampón carbonato (pH 10.2). Si la sonda es del tamaño correcto omitir el paso de hidrólisis, pero recuerde que debe añadir un formamida volumen, es decir, 30 l, a la sonda.

28. Prepare 0,2 M de bicarbonato de sodio (NaHCO ₃₎ y 0,2 M de carbonato de sodio (Na ₂ CO _3). Ambos deben ser frescos.
29. Prueba de los dos topes mediante la mezcla de 5 ml H ₂ O, 2 ml 0,2 M NaHCO ₃ y 3 ml de 0,2 M Na ₂ CO _3. El pH debe ser ~ 10.2.
30. Calcular el tiempo de incubación:

    El tiempo de incubación (en minutos) = (L 0-L f) / (K * L * L 0 f)

    L = 0 a partir de longitud de la sonda en kb

    L f = longitud final de la sonda en kb = 0.100 kb por ejemplo,

    K = tasa constante de hidrólisis = 0,11 kb-1min-1

31. Hidrolizar la mitad de la sonda, guarde el resto para más tarde. Diluir la sonda a 50 ml con agua libre de RNasa y se añaden 20 l 0,2 M NaHCO ₃ (añadir primero) y 30 l 0,2 M Na ₂ CO _3. Mezclar e incubar a 60 ° C durante el tiempo de incubación calculado.
32. Detener la reacción añadiendo 10 l de un pH 4,7 M NaOAc.
33. Precipitar la sonda mediante la adición de 10 l 4 M LiCl ₂ y 300 l etanol (glucógeno NB! uso o la acrilamida como soporte, si es necesario). Se incuba a 20 ° C durante la noche.
34. Centrífuga (13 000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C y retirar el sobrenadante. Lavar el sedimento dos veces en el 70% de etanol (~ 300 l). Centrífuga (13 000 rpm) por lo menos 10 minutos en cada lavado a 4 ° C.
35. Eliminar el sobrenadante y dejar que el pellet seco. Resuspender la sonda en 30 l de RNasa libre MilliQ de agua. Añadir un volumen de formamida, es decir, 30 l, a la sonda.
    Haga una pausa! La sonda puede ser almacenado a -20 ° C durante más de un año.
    NB! Tomar 2 l de la sonda no hidrolizadas y 2 l de la sonda hidrolizado (antes de la formamida se añade) y comprobar en un gel de nondenaturating TBE 1%. Debe haber una diferencia de tamaño entre las dos muestras. Las sondas que tenga que ser desnaturalizado a 80 ° C durante 5 minutos, seguido de enfriamiento en hielo antes de la carga.

4. Hibridación in situ (detalles Film! Técnico se muestran en la película)

Asegúrese de que todas las soluciones son RNasa libre! No es necesario tratar con DEPC todo, pero el uso de por lo menos en autoclave MilliQ de agua. Asegúrese de que todos los objetos de vidrio se calienta a 200 ° C durante la noche o por lo menos durante 5 horas. El tratamiento de los envases de plástico y revuelva barras con NaOH 0,1 M con agitación durante la noche. Enjuague los contenedores de plástico en varias ocasiones con autoclave MilliQ de agua (~ 500 ml / contenedor). Es crucial para enjuagar los recipientes con cuidado para evitar restos de NaOH que podrían dificultar la hibridación. DEPC tratar a todas las soluciones de reserva, salvo el Tris-buffer. Compruebe todas las soluciones, etc antes de comenzar el experimento para asegurarse de que todo está disponible. Hasta el paso 61 (con excepción de los pasos 51-52) que mantenga las diapositivas en un bastidor, que se mueve con facilidad entre los contenedores.

4.1 En la sección de pre-tratamiento in situ

36. Desparafinar / deshidratar secciones:

    2x 10 min Histoclear II (uso de envases de vidrio)

    2x 1-2 min EtOH al 100%

    1-2 min 95% EtOH

    1-2 min 90% EtOH

    1-2 min 80% EtOH

    1-2 min 60% EtOH

    1-2 min 30% EtOH

    1-2 min H 2 O

37. Se lavan los portas durante 15-20 minutos en 2 x SSC a temperatura ambiente (NB! Prepare el paraformaldehído utilizado en el paso 42 durante el tiempo de incubación).
38. El tratamiento de los tejidos durante 30 minutos con proteinasa K a 37 ° C con agitación suave (por ejemplo, 1 mg / ml de Arabidopsis / colza y de 3 mg / ml para el abeto rojo). Mezclar y precalentar a 37 ° C 100 mM Tris pH 8 y 50 mM EDTA. Añadir proteinasa K inmediatamente antes del tratamiento de las diapositivas. NB! El tratamiento con proteinasa K debe ser optimizado en función de los tejidos, las especies de plantas y la edad. (NB! Prepare la trietanolamina utilizado en el paso 45, durante el tiempo de incubación).
39. El tratamiento de las diapositivas durante 2 minutos con 2mg/ml glicina en 1x PBS a temperatura ambiente. (NB! Mezclar la glicina con PBS el día antes de usarlo para asegurarse de que la glicina esté bien disuelta).
40. Se lavan los portas durante 2 minutos en 1x PBS a temperatura ambiente.
41. Se lavan los portas durante 2 minutos en 1x PBS a temperatura ambiente.
42. Incubar los portaobjetos durante 10 minutos con un 4% (w / v) paraformaldehído (recién hecho) en 1x PBS pH 7 a temperatura ambiente. El uso de envases de vidrio.
43. Se lavan los portas durante 5 minutos en 1x PBS a temperatura ambiente.
44. Se lavan los portas durante 5 minutos en 1x PBS a temperatura ambiente. (Dispense anhídrido acético en la solución en el paso 45).
45. Incubar los portaobjetos durante 10 minutos en 0,1 M de trietanolamina (hecho pH fresco, 8) y el anhídrido acético a temperatura ambiente.
46. Se lavan los portas durante 5 minutos en 1x PBS a temperatura ambiente.
47. Se lavan los portas durante 5 minutos en 1x PBS a temperatura ambiente.
48. Deshidratar:

    30 seg 30% EtOH

    30 seg 60% EtOH

    30 seg 80% EtOH

    30 seg 90% EtOH

    30 seg EtOH al 95%

    2x 30 segundos EtOH al 100%

    Haga una pausa! Es posible parar aquí y guardar las diapositivas en un recipiente con una pequeña cantidad de EtOH en la parte inferior a + 4 ° C durante varias horas.

4.2 La hibridación in situ (Film! Los detalles técnicos se muestra en la película)

Decidir que se desliza para el uso de que las sondas, no se olvide de utilizar tanto el sentido y las sondas antisentido, así como un control positivo. (NB! ProbeOn Plus diapositivas de la Biotecnología Fisher tienen un glaseado blanco que les permite ser insertado en parejas durante las etapas de la hibridación / detección del protocolo.) La misma sonda con la misma concentración debe ser usado en un par de diapositivas específicas. Determine la cantidad de solución de hibridación para hacer en función del número total de pares de diapositivas. Precaliente el sulfato de dextrano en +60 ° C. La solución de hibridación es muy viscoso del sulfato de dextrano. Ponga la solución de hibridación en 60 ° C y será más fácil de manejar. Seque al aire las diapositivas en las toallas de papel o papeles Kimwipe / tejido antes de que la sonda se aplica. Las diapositivas deberán estar completamente secas. Para cada par de guías añadir la sonda. Es importante probar diferentes concentraciones de la sonda (por ejemplo, 0,5, 2 y 4 l) para encontrar la concentración óptima antes del experimento real es preformada.

Solución de hibridación	5 pares de diapositivas	10 pares de diapositivas	15 pares de diapositivas	20 pares de diapositivas
10x en sales in situ	100 l	200 l	300 l	400 l
formamida desionizada	400 l	800 l	1200 l	1600 l
50% de sulfato de dextrano (60 ° C)	200 l	400 l	600 l	800 l
Solución de 50x Denhardt	20 l	40 ml	60 l	80 l
tRNA (100mg/ml)	10 l	20 l	30 l	40 ml
H 2 O (DEPC tratados)	70 l	140 l	210 l	280 l
Volumen total	800 l	1600 l	2400 l	3200 l

49. Diluir la sonda en RNasa libre MilliQ de agua hasta un volumen final de 20 microlitros. Añadir un volumen (es decir, 20 l) formamida a la sonda para obtener un volumen total de 40 ml. El calor de la sonda a 80 ° C durante 2 minutos. Lugar en hielo durante 2 min. Espín hacia abajo. Mantenga la sonda en el hielo. Esta sonda mezcla es suficiente para un par de guías. Se multiplican según el número total de pares de diapositivas para la sonda específica.
50. Añadir 160 l de solución de hibridación para cada par de guías para obtener un volumen final de 200 l (160 l solución de hibridación de la sonda + 40 l) por cada par de diapositivas. Mezcla sin generar burbujas.
51. Aplicar la sonda a una diapositiva y poco a poco fusible los dos portaobjetos. (Intercalando NB! sólo se puede hacer con la sonda-en diapositivas Plus, o diapositivas equivalentes. Desliza sin helar se utilizan uso cubreobjetos en vez de sandwich.)
52. Elevar diapositivas sobre toallas de papel húmedo en un recipiente de plástico (que sella herméticamente), utilizando pipetas de plástico. Hibridar 50-55 ° C durante la noche (12.16 horas).

4.3 La hibridación in situ mensaje (Film! Los detalles técnicos se muestra en la película)

53. Prepare la hibridación in situ por el calentamiento posterior ~ 2 L 0,2 x SSC (55 ° C) y ~ 2 L 1x NTE (+37 ° C) durante la noche. Más cooperación Sur-Sur y la NTE son necesarios si el tratamiento de RNasa (pasos 57-59 abajo) se lleva a cabo.
54. Sumerja cada par de diapositivas en caliente SSC 0,2 x (ver arriba) para separar y enjuague. A continuación, colocarlos en una rejilla en un contenedorcon agua tibia SSC 0.2x.
55. Se lavan los portas durante 60 minutos en 0,2 x SSC con agitación suave a 55 ° C. (NB! Prepare la solución de bloqueo Boehringer utilizado en el paso 63 durante el tiempo de incubación).
56. Repita el lavado en 0,2 x SSC durante 60 minutos. (NB! Si el paso de RNasa se ​​lleva a cabo que el deshielo de RNasa durante la incubación, si no se continúe con el paso 60.)
57. Opcional: Se lavan los portas durante 5 minutos en agua tibia NTE 1x (ver más arriba) a 37 ° C con agitación suave.
58. Opcional: Repita el lavado de NTE 1x caliente durante 5 min a 37 ° C con agtation suave.
59. Opcional: Tratar las diapositivas con RNasa (20 mg / ml RNasa A en 1x NTE) durante 30 minutos a 37 ° C con agitación suave. Luego lavar durante 5 minutos en NTE 1x a +37 ° C con agitación suave. Repita el lavado NTE 1x.
60. Se lavan los portas durante 60 minutos en 0,2 x SSC a 55 ° C con agitación suave. (NB! Prepare la solución de bloque que se utiliza en los pasos 64-65 y 67 durante el tiempo de incubación).
61. Se lavan los portas durante 5 min en 1x PBS a temperatura ambiente (Pause! Usted puede guardar las diapositivas en 1XPBS a 4 ° C durante la noche si desea continuar al día siguiente.)
62. Colocar los portaobjetos en la parte inferior de un recipiente grande de plástico con el lado de la muestra.
63. Incubar el portaobjetos con un bloque de Boehringer% en 100 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM durante 45 min a temperatura ambiente con agitación suave. Sólo cubren los portaobjetos con la solución de bloqueo. Vierta la solución de bloqueo, mientras que las diapositivas todavía están en el contenedor de plástico o colocar los portaobjetos en un nuevo contenedor. Cuando vertiendo la solución de las diapositivas por lo general se adhieren al recipiente de plástico, pero asegúrese de que no se caigan fuera del contenedor.
64. Vuelva a colocar el bloque de Boehringer solución con 1,0% de BSA en 100 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,3% Triton X-100. Realizar la incubación como en el paso 63.
65. Diluir el anticuerpo anti-DIG (1:1250, es decir, 8 l anticuerpos en 10 ml de BSA) en la solución de BSA / Tris / NaCl / Triton de 64 pasos. Hacer un charco de solución de anticuerpos en una bolsa de pesar la cápsula. Sandwich portaobjetos, para permitir que las fuerzas capilares para tirar de la solución. Escurrir sobre papel Kimwipe / tejido y repito, tratar de evitar las burbujas.
66. Elevar diapositivas sobre toallas de papel húmedo en un recipiente de plástico y deje las diapositivas para sentarse a temperatura ambiente durante 2 horas.
67. Drenaje se desliza sobre Kimwipe / un pañuelo de papel y por separado. Coloque en el fondo del recipiente de plástico como en el paso 63. Lavar 4 veces en la solución de BSA / Tris / NaCl / Triton. 15 min cada vez, una suave agitación a temperatura ambiente.
68. 10 min 100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl _2. Coloque en el fondo del recipiente de plástico como en el paso 63.
69. Dip de diapositivas en Tris pH ₂ 9.5/NaCl/MgCl solución para asegurar que todos los de detergente se lava.
70. Haga sándwiches y elaborar una solución azul occidental como en el 65. Repetir una vez.
71. Colocar los portaobjetos en un recipiente de plástico por encima de las toallas de papel húmedo en la oscuridad total (envolver en papel de aluminio) por 1-5 días a temperatura ambiente. Verificación después de 6 horas, 12 y 24 de una vez todos los días.
72. Diapositivas Escurrir, enjuagar en 1xTE para detener la reacción. Puesto en la cubierta se desliza antes de las diapositivas se examinan en el microscopio. Las diapositivas se pueden guardar en 1x TE durante varios meses, pero tomar fotos tan pronto como sea posible.

RECETAS / SOLUCIONES DE ARCHIVO

NB! Uso libre de RNasa MilliQ de agua tanto como sea posible, por ejemplo, DEPC tratamiento MilliQ de agua (0,1% Añadir DEPC. Deje autoclave durante la noche. (20 minutos a 15 psi, es decir, 1,05 kg / cm ^2, en el ciclo de líquido) o su uso en al autoclave MilliQ de agua. En la preparación de tampones y soluciones de archivo también es posible disolver RNasa libre de sales, etc en el agua tratada con DEPC, en lugar de DEPC el tratamiento de los tampones y soluciones de valores propios. Si no DEPC tratar el agua , tampones y soluciones de archivo, al menos, esterilizar en autoclave o filtrarlos.
Haga una pausa! Buffers almacenar y soluciones en acciones a temperatura ambiente si no se indica otra cosa.
NB! Usted puede encontrar muchos de los amortiguadores, así como consejos sobre cómo hacer que en la clonación molecular (Sambrook, J., y Russell DW. 2001. Molecular Cloning Manual de Laboratorio. 3 ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE.UU.).

Anhídrido acético en 0,1 M de trietanolamina (pH 8, volumen: 800 ml).

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
Trietanolamina	10,4 ml	0,1 M de trietanolamina
MilliQ de agua	786,4 ml	volumen final de 800 ml
HCl	3,2 ml	dando pH8.0
El anhídrido acético	4,8 ml	0,6%

• Para hacer trietanolamina 0,1 M, pH 8,0, diluir 10,4 ml de trietanolamina en 786,4 ml de H ₂ O y añadir 3,2 ml de HCl para llevar el pH a 8.0 (consulte con el indicador de pH).
• Elevar el bastidor de diapositivas con pipetas de plástico rotos 10 ml o similar en un recipiente de trietanolamina con una barra de agitación en la parte inferior.
• Prescindir de 4,8 ml de anhídrido acético en la trietanolamina unos minutos antes de poner diapositivas en la que se mezcla bien.

NB! Hacer la trietanolamina 0,1 M fresco y el anhídrido acético, añadir justo antes de la incubación.
NB! El uso de envases de vidrio. Trietanolamina buffer debe ser utilizado por el anhídrido acético es inestable en el agua.

Agarosa (1%) en gel de 1 x TBE (volumen: 100 ml)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
Agarosa	1 g	1%
1 x TBE	hasta 100 ml

Mezcla de agarosa con 1 x TBE. Calor / hervir hasta que la agarosa se haya derretido. Lanzar un gel. Correr el gel en una solución tampón 1 x TBE.

Sulfato de dextrano

Diluir 5 g de sulfato de dextrano a 10 ml con tratada con DEPC MilliQ de agua (es decir, 50% (w / v)) y se disuelven en 60 ° C.
Haga una pausa! Almacenar a -20 ° C.

EDTA 0,5 M pH 8,0 (Titriplex III, volumen 500 ml)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
EDTA (372,24 g / mol)	93,06 g	EDTA 0,5 M
MilliQ de agua	hasta 500 ml
NaOH	~ 10 g pellets	dar a pH 8,0
DEPC	0,5 ml	0,1% DEPC

Disolver el EDTA en agua (que sucede a pH 8,0), ajustado a un volumen final de 500 ml. Añadir 0,1% DEPC. Deja toda la noche. Autoclave.

Fix solución / fijador (pasos 1-3, 42) - 4% (w / v) de paraformaldehído en PBS 1x, pH 7,0 (650 ml)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
MilliQ de agua	585 ml
10x PBS	65 ml	1x PBS
10M NaOH	520 l	pH da ~ 11
Paraformaldehído	26 g	4%
HCl concentrado	449 l	pH da ~ 7

• Mezclar el agua, PBS y NaOH y el calor a 60-70 ° C (la temperatura y el pH alto, será más fácil de disolver el paraformaldehído.
• Añadir (en campana extractora de humos) paraformaldehído.
• Cuando la solución se ha despejado el lugar en el hielo y ajustar el pH a 7,0 mediante la adición de 449 l de HCl concentrado.

NB! Hacer fresco.
NB! En el protocolo de glutaraldehído abeto se añadió a una concentración final de 0,25%, es decir, 6,5 ml de glutaraldehído al 25% del volumen total de 650 ml o 10 ml de glutaraldehído al 25% del volumen total de 1.000 ml (recuerde que para reducir el agua con un igual volumen).
NB! Añadir unas gotas de Tween 20 y / o Triton X-100, se ajusta el pH, para reducir la tensión superficial para facilitar la fijación en los pasos 1-3. NO UTILICE EN EL PASO 42!
NB! La fijación de tejidos de la planta un volumen menor (por ejemplo, 100 - 200 ml) de fijador es generalmente necesario.

10x en sales in situ (volumen 100 ml)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
5 M NaCl	60 ml	3M NaCl
1 M Tris-Cl pH 8,0	10 ml	0,100 M Tris
1 M Na fosfato pH 6,8	10 ml	0,100 M Na fosfato
EDTA 0,5 M	10 ml	0,050 M EDTA
MilliQ de agua	hasta 100 ml

Mezcla de un tampón fosfato de Na con un pH de 6,8 (46,3 ml 1 M Na ₂ HPO ₄ + 53,7 ml de 1 M NaH ₂ PO _4). Mezcla de NaCl, Tris, Na tampón fosfato, EDTA y agua. Autoclave. Pausa! Almacenar a -20 ° C.

4 M LiCl ₂ (cloruro de litio, el volumen: 100 ml)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
LiCl 2 (42,39 g / mol)	16,956 g	4M LiCl 2
MilliQ de agua	hasta 100 ml
DEPC	0,1 ml	0,1% DEPC

Disolver LiCl ₂ en el agua, adaptarse a un volumen final de 100 ml. Añadir 0,1% DEPC. Deja toda la noche. Autoclave.
Haga una pausa! Almacenar a 4 ° C.

1 M de MgCl _{2 ·} H ₂ O (cloruro de magnesio, el volumen: 100 ml)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
De MgCl 2 · H 2 O (203,30 g / mol)	20,33 g	1 M de MgCl 2 · H 2 O
MilliQ de agua	hasta 100 ml
DEPC	0,1 ml	0,1% DEPC

Disolver en agua de MgCl _2, ajustarse a un volumen final de 100 ml. Añadir 0,1% DEPC. Deja toda la noche. Autoclave.
NB! _MgCl2 es muy higroscópico. No almacene las botellas abiertas por largos periodos de tiempo.

5 M NaCl (cloruro de sodio, el volumen: 1 l)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
NaCl (58,44 g / mol)	292,2 g	5 M NaCl
MilliQ de agua	hasta 1 litro
DEPC	1 ml	0,1% DEPC

Disolver NaCl en agua, adaptarse a un volumen final de 1 l. Añadir 0,1% DEPC. Deja toda la noche. Autoclave.

1 M NaOAc pH 4,7 (acetato de sodio, el volumen: 100 ml)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
NaOAc (82,03 g / mol)	0,8203 g	1 M NaOAc
MilliQ de agua	hasta 100 ml
El ácido acético		dar a pH 4,7
DEPC	0,1 ml	0,1% DEPC

Disolver NaOAc en el agua. Ajustar el pH a 4.7. Ajuste un volumen final de 100 ml. Añadir 0,1% DEPC. Deja toda la noche. Autoclave.

0,2 M Na ₂ CO ₃ pH11.4 (carbonato de sodio, el volumen: 10 ml)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
Na 2 CO 3	0,21198 g	0,2 M Na 2 CO 3 pH = 11,4
MilliQ de agua	hasta 10 ml

Disolver Na ₂ CO ₃ en agua, ajustar a un volumen final de 10 ml. El pH debe ser 11.4.
NB! Hacer fresco.

0,2 M NaHCO ₃ pH8.2 (bicarbonato de sodio, el volumen: 10 ml)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
NaHCO3	0,16802 g	0,2 M NaHCO 3: pH = 8,2
MilliQ de agua	hasta 10 ml

Disolver NaHCO ₃ en el agua, adaptarse a un volumen final de 10 ml. El pH debe ser 8,2.
NB! Hacer fresco.

1 M Na ₂ HPO ₄ · 2 H ₂ O (volumen 500 ml)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O (177,99 g / mol)	88,995 g	1 M Na 2 HPO 4
MilliQ de agua	hasta 500 ml
DEPC	0,5 ml	0,1% DEPC

Disolver Na ₂ HPO ₄ en el agua, adaptarse a un volumen final de 500 ml. Añadir 0,1% DEPC. Deja toda la noche. Autoclave.

1 M NaH ₂ PO _{4 ·} H ₂ O (volumen 500 ml)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
NaH 2 PO 4 · H 2 O (137,99 g / mol)	68,995 g	1 M NaH 2 PO 4
MilliQ de agua	hasta 500 ml
DEPC	0,5 ml	0,1% DEPC

Disolver NaH ₂ PO ₄ en el agua, adaptarse a un volumen final de 500 ml. Añadir 0,1% DEPC. Deja toda la noche. Autoclave.

NTE 5x (volumen total: 1 l)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
5 M NaCl	500 ml	2,5 M NaCl
1 M Tris-Cl pH 8	25 ml	50 mM Tris-Cl pH 8
EDTA 0,5 M	5 ml	5 mM EDTA
MilliQ de agua	470 ml	1l volumen final

Mezcla de NaCl, Tris, EDTA y agua. No DEPC tratar. Autoclave.

10 x PBS (buffer fosfato salino) pH 7.0 (volumen total: 1 l)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
5 M NaCl	260 ml	1,3 M NaCl
1 M Na 2 HPO 4	70 ml	70 mM Na 2 HPO 4
1 M NaH 2 PO 4	30 ml	30 mM NaH 2 PO 4
MilliQ de agua	640 ml	1l volumen final
DEPC	1 ml	0,1% DEPC

Mezcla de NaCl, Na ₂ HPO _4, NaH ₂ PO ₄ y el agua. Ajustar el pH a pH 7,0 con HCl. Añadir 0,1% DEPC. Deja toda la noche. Autoclave.

20x SSC pH 7,0 (volumen total: 1 l)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
NaCl (58,44 g / mol)	175,32 g	3 M NaCl
Citrato de Na (294,1 g / mol)	88,23 g	0,300 M Na Citrato
MilliQ de agua	hasta 1 l
HCl		dando un pH de 7,5
DEPC	1 ml	0,1% DEPC

Disolver NaCl y citrato de sodio en el agua ~ 800 ml. Ajustar el pH a pH 7,0 con HCl. Ajuste el volumen a 1 l con agua. Añadir 0,1% DEPC. Deja toda la noche. Autoclave.

5 x TBE (volumen: 1 l)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
Tris (121,14 g / mol)	54 g	~ 0,45 M Tris
Ácido bórico (61,83 g / mol)	27,5 g	~ 0,45 M de ácido bórico
EDTA (372,24 g / mol)	3,7 g	~ 0,01 M EDTA
MilliQ de agua	hasta 1 litro

Mezcla de Tris, ácido bórico, EDTA y agua. El pH debe ser ~ 8,3. Diluir a 1 x TBE antes de su uso.

10 x TE pH 8,0 (Tris EDTA, volumen: 1 l)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
1 M Tris-Cl, pH 8,0	100 ml	0,100 M Tris-Cl
EDTA 0,5 M pH 8,0	100 ml	0,050 M EDTA
MilliQ de agua	hasta 1 litro

Mezcla de Tris, EDTA y agua. No DEPC tratar. Autoclave.
NB! Tris no debe ser tratada con DEPC! Uso libre de RNasa en polvo y se diluye con DEPC-treated/RNase-free MilliQ de agua.

1 M Tris-HCl pH 7,5 a 9,5 (volumen 500 ml)

Ingrediente	volumen / cantidad	concentración final
Tris (121,14 g / mol)	60,57 g	1 M Tris
MilliQ de agua	hasta 500 ml
HCl		dando un pH de 7,5
HCl		dar a pH 8,0
NaOH		dando un pH de 9,5

Disolver Tris en agua tratada con DEPC. Ajustar al pH deseado. Ajuste un volumen final de 500 ml. Autoclave.
NB! Tris no debe ser tratada con DEPC! Uso libre de RNasa en polvo y se diluye con DEPC-treated/RNase-free MilliQ de agua.
NB! En la clonación molecular (ver arriba) hay una tabla que describe la cantidad de HCl concentrado se necesita para alcanzar el pH correcto.

MATERIAL Y MÉTODOS

El protocolo en situ es el que antecede y en la película. Información adicional de aquí el material vegetal y sondas utilizadas en este ejemplo concreto se describen.

Material vegetal y diseño experimental

Conos masculinos de Picea abies [L] Karst. (Abeto rojo) se recogieron en Uppsala, Suecia, el otoño de 2007. Ocho conos fueron seccionadas y secciones decada cono se utilizan en cada tratamiento. Tres proteinasa K concentraciones fueron probados, 1, 3 y 5 mg / l y la concentración de cada uno, fueron tratados con o sin RNasa. Las diapositivas no tratados con RNasa se ​​quedaron en PBS durante el tratamiento con RNasa. Arabidopsis thaliana [L] Heynh. y Brassica napus L., se cultivan en condiciones controladas en cámara de cultivo con el 22 º C/18 º C día / noche las temperaturas y un fotoperíodo de 16 h. Inflorescencias jóvenes que contiene botones florales, las etapas 0-10 (etapas de acuerdo con Smyth ⁵⁾ fueron estudiados.

cRNA sondas

ARN total fue aislado de P. abies conos masculinos como se describió anteriormente 6 y de A. thaliana y B. napus usando Trizol (Gibco BRL, Frederick, Maryland, EE.UU.) y la Planta de Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania), respectivamente, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El cDNA fue sintetizado a 0,5 a 1 mg de ARN total, dependiendo de la especie, utilizando Superíndice III de la transcriptasa inversa (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. AtAP3 y BnAP3 sentido y fragmentos de antisentido y P. fragmentos abies sentido fueron aislados y amplificados utilizando primers específicos de genes (Tabla 1). DAL13 fragmentos antisentido fueron aislados y amplificado utilizando los primers como en 7. Un voladizo T7 se añadió a los fragmentos de A. thaliana y P. abies utilizando modificado atrás primers llevar la T7-secuencia (Tabla 1). Un fragmento de 500 pb fue aislado utilizando BnAP3 primers específicos (Tabla 1) y se clonó en un vector pGEM-T con una T7-promotor. Para el P. abies fragmentos de todas las reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 20 l que contenía 0,2 U Phusion alta Fidility ADN polimerasa (Finnzymes, Espoo, Finlandia), 1x Phusion HF tampón, 200 mM de cada dNTP, 0,3 mM de cada imprimación y 25-50 ng de cDNA y un programa estándar de PCR se utilizó con la temperatura de recocido 60-55 ° C (la toma de contacto -1 ° C / ciclo), seguido de 55 ° C. Sentido y antisentido cRNA sondas para las tres especies fueron sintetizados con la transcripción in vitro utilizando el kit de etiquetado DIG RNA (SP6/T7; Roche Ciencias Aplicadas, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y las sondas de largo fueron digeridos con aproximadamente 100-150 pb fragmentos con un Na ₂ CO ₃ de amortiguación de acuerdo a ^tres.

RESULTADOS

Aquí, en el resultado sección se describen tres ejemplos diferentes de los resultados típicos de experimentos in situ.

El mecanismo genético que regula el desarrollo reproductivo en gimnospermas y angiospermas por la identidad especifica de órganos masculinos y femeninos parece ser conservado evolutivamente ^7-9 a pesar de que los dos linajes separados de semillas de plantas hace 285 millones años ^10. En A. thaliana los genes homeóticos florales APETALA3 (AP3 ¹¹⁾ y PISTILLATA (IP ¹²⁾ son necesarias y suficientes para especificar el desarrollo reproductivo masculino en el contexto de una flor, y esta función parece ser conservadas en el linaje de las angiospermas ^13. En las gimnospermas, que carecen de flores y tienen sus órganos reproductores dispuestos en distintos conos masculinos y femeninos (Fig. 1A-C), genes homólogos a AP3 y PI se expresan específicamente en los órganos que producen polen del cono masculino, el microsporophylls ^7,14. Por lo tanto, un conjunto similar de genes homólogos, tanto en angiospermas y gimnospermas define los órganos de polen fértil.

Sondas genéticas específicas dirigidas contra AtAP3 y BnAP3, respectivamente, dio señales de la etapa 3 de los jóvenes brotes florales en una región que corresponde a la espiral de dos y tres en la A. thaliana y B. napus. En etapas posteriores brotes de las señales se limitaron a desarrollar pétalos y estambres (Fig. 2A y B). Estos resultados están de acuerdo con estudios previos ^11,15,16. Sondas dirigidas hacia la AP3 homólogo en P. abies, DAL13, produce señales en el microsporophylls de P. abies conos masculinos, tanto antes como después de la terminación meristemo apical (Fig. 2C y D), como se espera de los estudios previos ^7,14. Sondas sentido dio ninguna señal por encima del fondo (Fig. 3A-B y los datos no mostrados). En conjunto, estos resultados demuestran la expresión de A. thaliana AP3 y su orthologs en ​​B. napus y P. abies en el desarrollo de los órganos reproductivos masculinos.

Figura 1. A.thaliana y B. napus flores y el polen producen conos masculinos de la P. de coníferas Fotos abies muestran inflorescencias con botones florales y flores abiertas de A.thaliana y B.napus en A y B, respectivamente. Tenga en cuenta que las flores de las angiospermas, aparte de la perianto estéril alberga los órganos reproductivos tanto masculinos como femeninos, estambres y carpelos. Se muestra en C es una rama de las gimnospermas P. abies con agujas verde vegetación y el rojo conos reproductivo masculino.

Figura 2. Expresión de A. AP3 thaliana y los genes homólogos en B. napus y P. abies. Micrografías muestran secciones longitudinales de A. thaliana y B. inflorescencias napus en A y B, respectivamente, y P. abies conos masculinos en C y D. Secciones hibridación con sondas antisentido dirigidos contra AtAP3 en señal de muestra A y B BnAP3 en el segundo y tercer verticilo órganos florales. Números indican las fases florales, de acuerdo a Smyth ^5. Antisentido sonda dirigida hacia el gen DAL13 dio la señal en el microsporophylls que producen polen de P. abies conos masculinos, como se muestra en CD. Ejemplos de microsporophylls se indican con flechas. Puntas de flecha en el punto de AD a la señal de hibridación, que aparece como morado. En C y D compuestos fenólicos dan color marrón inespecífica a celdas individuales en la médula central. s, sépalo, p, pétalo, st, estambre, c, carpelo; ms, microsporophyll, pi, medulares, pp; pre-polen de las células. Bar: 100 micras.

Figura 3. DAL13 expresión en conos masculinos de P. abies. Todas las micrografías (AH), se muestran las secciones longitudinales de conos masculinos después de la terminación meristema apical. Puntas de flecha a punto de los tipos de células en las que se expresa DAL13. Las secciones en A, B y se hibridan con una sonda de control de los sentidos para determinar la tinción de fondo. Micrografías C a H se hibridan con una sonda antisentido DAL13. Secciones de los experimentos con y sin RNasa tratamiento se muestran en D, F, H y C, E, G, respectivamente. Micrografías de los experimentos con 1 mg / ml de proteinasa K se muestran en la C y D, 3 mg / ml en E y F, y 5 mg / ml de G y H. Bar: 100 micras.

Discusión

Dos aspectos de la P. abies protocolo han sido optimizados en comparación con el A. thaliana / B. napus protocolo, RNasa tratamiento y la concentración de proteinasa K. La RNasa elimina las señales de fondo y por lo tanto aumenta la especificidad de la señal ^17. El tratamiento con proteinasa K es necesaria para permeabilizar los tejidos por lo que la sonda se puede entrar y se hibridan con la piscina de ARN de interés. La sonda antisentido DAL13 dio una señal de alto, sin RNasa tratamiento (Fig. 3C, E, G) en comparación con las secciones tratadas con RNasa durante 30 minutos (Figura 2 D, F y H). Dado que la RNasa tratamiento no mejoró la señal que fue retirada del protocolo. El tratamiento con proteinasa K se pusieron a prueba a tres concentraciones diferentes: 1, 3 y 5 mg / ml. En el caso de P. abies una señal de baja o no se observó con 1 mg / ml de proteinasa K (Fig. 3C-D). Una señal fuerte se obtuvo con los 3 mg / ml (Fig. 3E-F) y 5 mg / ml (Fig. 3G-H) proteinasa K. Puesto que no hay diferencia aparente en la intensidad de la señal cuando se encontró con 5 mg / ml de proteinasa K en comparación con 3 mg / ml, se optó por utilizar 3 mg / ml en el protocolo. Es probable que la necesidad de una concentración de proteinasa K más alto en el P. abies conos masculinos en comparación con el A. thaliana y B. yemas florales napus se debe a la mayor cantidad de tejido compacto con altos niveles de compuestos fenólicos y polisacáridos.

Durante la fijación e inclusión algunas diferencias entre el A. thaliana / B. napus protocolo y la P. abies protocolo son evidentes. El tejido de interés es fijo para proporcionar la retención de ARN y este es un paso crítico ya que los materiales mal fijo podría dar una señal de baja o no detectable a pesar de que el ARNm es muy abundante. El tejido se deshidrata, se aclaró y embebidos en cera en los cambios graduales para evitar daños en los tejidos, y en algunos protocolos de NaCl 0,85% se añade a la de etanol en la deshidratación para evitar aún más la contracción y la hinchazón de las ^tres células. La etapa de deshidratación durante la incrustación se puede realizar en el hielo para mantener la actividad RNasa como mínimo. En el P. abies protocolo de la solución de paraformaldehído al 4% solución contiene 0,25% de glutaraldehído, que se supone que para dar una mejor retención de ARN de ¹⁷ a pesar de que algunos sostienen que es probable que no hacen ninguna diferencia ^3. Después de seccionar el material se fija en las diapositivas y los tratados previamente (es decir, desparafinado, rehidratada, permeabilized, tratados para reducir la unión no específica de la sonda y se deshidrata por fin) antes de la hibridación.

En el protocolo que aquí se presenta el procedimiento de detección de todo se puede realizar en los laboratorios ordinarios, la señal se desarrolla por lo general dentro de 1-3 días y la relación entre la señal más de fondo continua puede controlarse. El DIG marcado sondas suelen dar una señal más clara, en comparación con sondas marcadas radiactivos, son más estables y pueden ser reutilizados en experimentos consecutivos. Por otro lado, la sensibilidad se reduce en comparación con sondas radiactivas ^17. Hibridación in situ detecta expresión utilizando una sonda marcada específica para un determinado ARNm. Radio-etiquetado es un método de etiquetado robusta y sensible, pero requiere de un manejo de la radiactividad y toma varias semanas antes de que los resultados pueden ser detectados. Antígeno marcado con sondas por el contrario, son más estables, menos peligrosos y requieren de la exposición al medio de la detección de un par de días sólo ^{17 años.} Por lo tanto, el etiquetado de antígeno métodos son actualmente dominantes. El paso más importante independientemente del protocolo es el diseño de la sonda. Se debe tener cuidado para asegurarse de que la sonda tiene una alta especificidad y se etiqueta con UTPs de alta calidad. A veces la temperatura de hibridación y / o la longitud de la reacción tiene que ser ajustado para las sondas específicas.

Nuestro protocolo modificado sobre la base de la etiqueta DIG-sondas facilitará la localización de la expresión del ARNm de manera simultánea en las especies que van desde A. thaliana a P. abies, y que con algunos ajustes menores pueda utilizarse en otras especies vegetales. El protocolo, además de los conos masculinos, también ha sido probado en diferentes etapas de brotes vegetativos y en ambos cigóticos y somáticos de P. abies, con buenos resultados (resultados no publicados;. Karlgren et al).

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic anhydride	Sigma-Aldrich	A6404-200ml	minimum 98%
Acrylamide, linear	Ambion	9520
Anti-DIG-antibodies	Roche Group
Blocking reagent	Roche Group	11 175 041 910 or 11 096 176 001
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50g	minimum 98%
Deionized formamide	Sigma-Aldrich
Denhardts solution	Sigma-Aldrich	D2532-5ml
DEPC, diethylpyrocarbonate	Sigma-Aldrich
Dextran sulfate	Sigma-Aldrich
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)	Roche Group	11175025910
Glutaraldehyde (25%)	Histolab
Glycogen	Ambion	9510G
Histoclear II	Histolab		You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Histowax	Histolab		Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500g
Paraplast plus	Sigma-Aldrich	P3683-1kg	Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Phusion™ High-Fidility DNA Polymerase	Finnzymes
Probe-on Plus slides	Fisher Scientific	22-230-900
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308-5mg
RNase A	Sigma-Aldrich	R5503-100mg
Tissue-clear	Sakura Finetek		You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	T1377-100ml	minimum 98%
Triton X-100	use your standard product in the lab		Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
tRNA	Sigma-Aldrich	83853-100mg
Tween-20	use your standard product in the lab		Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
Western Blue	Promega Corp.