Aislamiento de células de ratón cavidad peritoneal

Resumen

La cavidad peritoneal de los mamíferos contiene diferentes poblaciones de células inmunes crucial para la respuesta inmune innata. Un método eficaz aislamiento es necesario para los análisis bioquímicos y funcionales de estas células. Aquí le ofrecemos un método integral para el aislamiento de las células en la cavidad peritoneal del ratón.

Resumen

La cavidad peritoneal es una cavidad abdominal a la membrana y lleno de líquido de los mamíferos, que contiene el hígado, el bazo, la mayor parte del tracto gastro-intestinal y otras vísceras. Alberga un número de células inmunes como los macrófagos, células B y células T. La presencia de un gran número de macrófagos ingenuo en la cavidad peritoneal lo convierte en un lugar preferido para la recogida de los macrófagos tisulares residentes ingenua (1). La cavidad peritoneal es también importante para el estudio de las células B debido a la presencia de una única cavidad peritoneal residentes subconjunto de células B, conocidas como células B1, además de las células B2 convencionales. Las células B1 están divididas en las células B1a y B1b, que se distingue por la expresión superficial de CD11b y CD5. Las células B1 son una fuente importante de IgM natural que proporciona la protección temprana de una variedad de agentes patógenos (2-4). Estas células son autorreactivos en la naturaleza (5), pero la forma en que se controlan para evitar la autoinmunidad todavía no se entiende completamente. Por el contrario, CD5

Protocolo

1. Antes de iniciar el proceso, los siguientes elementos deben ser recogidos y preparados:
   • Hielo
   • Jeringa de 5 ml con aguja 27G
   • Jeringa de 5 ml con aguja 25G
   • Espuma de poliestireno de bloque y los pernos para el montaje del ratón
   • Bandeja en la que se puede colocar el bloque de montaje
   • Tijeras y pinzas
   • Tubos de recogida de
   • 70% de etanol
   • PBS con 3% de suero fetal bovino (FCS) (Pre frío y se mantuvo en hielo)
2. Practicar la eutanasia con el ratón, lo rocía con un 70% de etanol y montarla en el bloque de espuma de poliestireno en la espalda.
3. Utilizando unas tijeras y pinzas de cortar la piel exterior del peritoneo y tire de él hacia atrás para exponer la piel interna que recubre la cavidad peritoneal.
4. Inyectar 5 ml de PBS enfriado con hielo (con 3% de FCS) en la cavidad peritoneal usando una aguja 27G. Empuje la aguja lentamente en el peritoneo con cuidado de no perforar ningún órgano.
5. Después de la inyección, masajear suavemente el peritoneo para desalojar las células adjunto en la solución de PBS.
6. Inserte una aguja de 25 g, el bisel hacia arriba, unida a una jeringa de 5 ml en el peritoneo y recoger el líquido mientras se mueve la punta de la aguja con cuidado para evitar la obstrucción por el tejido adiposo u otros órganos. Recoger la mayor cantidad de líquido posible y depósito de la suspensión celular en tubos se mantuvieron en hielo después de retirar la aguja de la jeringa.
   Opcional: Repita los pasos 4-6
7. Hacer una incisión en la piel interior del peritoneo y mientras mantiene la piel con una pinza de utilizar una pipeta de plástico Pasteur para recoger el líquido residual de la cavidad.
8. Si en el paso 6 o 7 contaminación de la sangre visible se detecta la muestra contaminada debe ser descartada.
9. Haga girar la suspensión de células recogidas a 1500 rpm durante 8 minutos, descartar el sobrenadante y resuspender las células en los medios de comunicación que desee o PBS para el conteo.

Protocolo alternativo para obtener tioglicolato suscitó macrófagos:

Este método se utiliza para obtener un mayor rendimiento de los macrófagos.

1. Inyectar 5 ml de 3% (w / v) Brewer tioglicolato medio (7) en la cavidad peritoneal de los ratones.
2. Esperar durante 3-5 días, y vaya al paso 1 anterior para la recogida de las células.

En comparación con el enfoque nonelicited, aproximadamente 10 veces más macrófagos pueden ser recogidos. La única preocupación es que los macrófagos obtenidos por este procedimiento difieren en algunas de sus propiedades fisiológicas.

Los resultados representativos:

De un ratón sin manipular, 5-10 millones de células de la cavidad peritoneal se puede obtener con un protocolo de un buen aislamiento. Entre todas las células vivas, el 50-60% son células B, los macrófagos ~ 30% y el 10.5% son células T (Fig. 1).

Figura 1. Fenotipo de células aisladas de la cavidad peritoneal. Después de aislamiento de las células de la cavidad peritoneal se tiñeron con anti-ratón TCRβ-FITC, B220-PE-Texas rojo, CD11b-azul del Pacífico, CD23-PE-Cy7 y CD5 APC. Parcelas representativas de citometría de flujo muestran los porcentajes de células B y T (a), los macrófagos (b), B1 y B2 células (c) y las células B1a y B1b (d).

Discusión

El aislamiento de células cavidad peritoneal es una técnica importante para el estudio de diferentes células del sistema inmune, los macrófagos y sobre todo específicos subconjuntos de células B. Aunque este es un proceso sencillo, hay algunos pasos críticos implicados. Presencia de contaminación de la sangre en la muestra recogida se debe evitar para obtener una población pura de células peritoneal cavidad. La eutanasia por dislocación cervical debe hacerse con cuidado para evitar la contaminación de la sangre en la cavidad peritoneal. Por otra parte CO ₂ puede ser utilizado. Además, durante el procedimiento adecuado cuidado se debe tomar para evitar perforar la vejiga o de otros órganos en la cavidad peritoneal. La recuperación de la mayoría de los fluido que se inyecta es también importante para el rendimiento celular.

Este procedimiento es ampliamente usado para estudiar la biología de los macrófagos ya que un número moderado de residentes, los macrófagos estimulados se puede obtener fácilmente de la cavidad peritoneal, en contraste con la laboriosa tarea de diferenciación de las células mieloides progenitoras en macrófagos maduros in vitro, utilizando el factor estimulante de colonias de macrófagos (8 , 9). El rendimiento de los macrófagos de la cavidad peritoneal puede ser mejorada mediante el método de obtención de tioglicolato, aunque el uso de tioglicolato podría alterar las propiedades fisiológicas de los macrófagos (7).

Las células B son una parte importante de nuestro sistema inmunológico juega un papel crucial en la inmunidad innata y adaptativa. Entre las diferentes subpoblaciones de células B, células B1 constituyen un subconjunto único de las células B participan en la inmunidad innata, la autoinmunidad y la regulación inmune. Las células B1 se ubican principalmente en la cavidad peritoneal y la reposición de uno mismo. Se trata de uno de los principales productores de IgM naturales que proporciona la primera línea de protección contra una serie de virus y bacterias (10-12). Las células B1 son también una fuente importante de IL-10 (6), que es una citocina importante implicado en la regulación inmune. Aunque varios estudios han llevado a cabo con las células B1, todavía hay margen para una mayor evaluación de sus funciones, en contraste, en especial su papel regulador. Celular cavidad peritoneal método de aislamiento ofrece la oportunidad única de estudiar las funciones de las células B1.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thioglycollate Medium, Brewer Modified	BD Biosciences	211716