El uso de SC1 (Pluripotin) para apoyar MESC auto-renovación en la ausencia de LIF

Resumen

SC1 funciones a través de la inhibición dual de Ras-GAP y ERK1. Pusimos a prueba la función de SC1 en el apoyo de células ES de ratón de auto-renovación en la ausencia de LIF y demostró que SC1 es capaz de mantener la auto-renovación de los cultivos celulares de ratón ES.

Resumen

Madre embrionarias de ratón (ES) las células son cultivadas convencionalmente con factor inhibidor de leucemia (LIF) para mantener la auto-renovación.

Protocolo

1. Preparación de las placas de alimentación MEF

1. Un día antes de que el cultivo de células madre embrionarias, descongele un vial de irradiados E14.5 CF-1 células alimentadoras MEF (ver nuestro procedimiento sobre la forma de descongelar las células ES).
2. Placa de las células de alimentación MEF, con una densidad de 10.000 células / pocillo en una placa de 12 también. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C y 5% CO _2. MEF celular medios de comunicación: DMEM suplementado con 10% ES-PBS, la glutamina 1X y 1X no aminoácidos esenciales.

2. Mantenimiento de auto-renovación de las células madre embrionarias de ratón

1. Separar las células madre embrionarias con tripsina. Sembrar las células a una densidad de 50.000 células / pocillo en las placas de alimentación preparada previamente MEF en medios de cultivo (MEM golpe de gracia complementado con un 15% KSR, 4 mM L-glutamina, 0,1 mM no aminoácidos esenciales y BME 1X), complementado con SC1 a la concentración deseada (en el ejemplo 100 nm, 300 nm, y M 1). También hemos añadido un control positivo, así que fue complementado con 1000 μ / ml de LIF. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C y 5% CO _2.
2. Cultivo de las células a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 3-4 días en cada paso. Actualizar los medios de comunicación cada 48 horas.
3. Células paso 1:10-1:15 con tripsina para mantener una densidad similar a la densidad de siembra inicial. Después de cinco pasajes, las células pueden ser examinados para la expresión de marcadores de pluripotencia típicos utilizando inmunocitoquímica.

3. El examen de inmuno marcadores de pluripotencia

1. Lave suavemente las células tres veces con PBS.
2. Fijar las células con 500 l de solución fijadora durante 20 minutos a temperatura ambiente.
3. Lave suavemente las células tres veces con PBS.
4. Bloquear la unión no específica con 500 l de amortiguación de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente.
5. Se incuban las células con 250 l de la primaria de anticuerpos específicos (en el ejemplo Nanog, Sox2, SSEA1 y Oct4 en las siguientes diluciones: 1:500, 1:2000, 1:500 y 1:500)
6. Lave suavemente las células tres veces con PBS.
7. Se incuban las células con 250 l de anticuerpo secundario durante dos horas a temperatura ambiente, manteniéndose alejado de la luz (en el ejemplo burro anti-ratón conjugado con Alexa Fluor ® 555 a 1:2000 y burro anti-conejo conjugado con Alexa Fluor ® 488 a 1 : 2000).
8. Lave suavemente las células tres veces con PBS.
9. Añadir DAPI (concentración final de 1 mg / ml) para el último lavado e incubar 5 minutos para visualizar los núcleos.
10. Analizar las células bajo un microscopio de fluorescencia.

4. Los resultados representativos:

1. Resultados de la morfología:

Células madre embrionarias de ratón (ESC R1) fueron cultivadas en células alimentadoras MEF en la presencia de cualquiera de LIF o SC1 para mantener la auto-renovación en un estado indiferenciado. Después del segundo paso, la diferenciación se puede observar en las células sin LIF o SC1 (control negativo) y después de 5 pasajes prácticamente no se observaron colonias indiferenciadas. LIF (control positivo) colonias tratadas se mantuvo en un estado indiferenciado de los 5 pases celulares. Las células tratadas con SC1 a concentraciones de 300 nm o 100 también se mantuvo diferenciado después de 5 pasajes, sin embargo, las células tratadas con 1 mM SC1 muerte celular experimentado tras el paso cuarto. (Fig 2 de la nota de aplicación) La Tabla 1 resume las observaciones morfológicas.

2. Expresión de marcadores de pluripotencia

Células ES de ratón mantuvo durante 5 pasajes fueron fijados y examinados por inmunohistoquímica para SSEA1, Oct4, Sox2 y Nanog. Expresión de los marcadores fue similar a las células mantenidas en LIF. (Fig 3 y 4 de la nota de aplicación)

Figura 1: Comparación de Morfología de las células mantenidas en LIF o SC1. No se observaron diferencias en la morfología se observó.

Figura 2 y Figura 3: Nanog, SSEA1, Sox2, Oct4 y la tinción de células madre embrionarias mantiene con SC1 o LIF (fig 4 de la nota de aplicación). Células mantenidas en SC1 mostrar expresión similar marcador de pluripotencia de las células mantenidas en LIF.

Tabla 1

	Control Negativo	LIF control positivo	SC1 1um	SC1 300 nM	SC1 100 nM
Primero paso	ES normal de la morfología celular	ES normal de la morfología celular	ES normal de la morfología celular	ES normal de la morfología celular	ES normal de la morfología celular
El paso segundo	Algunos morfología diferenciada	E normalesS morfología de las células	ES normal de la morfología celular	ES normal de la morfología celular	ES normal de la morfología celular
El paso tercero	La mayoría de las células diferenciadas	ES normal de la morfología celular	ES normal de la morfología celular	ES normal de la morfología celular	ES normal de la morfología celular
Paso cuarto	No colonias CES	ES normal de la morfología celular	La muerte celular observada	ES normal de la morfología celular	ES normal de la morfología celular
Pasaje quinto	diferenciado	ES normal de la morfología celular	La muerte celular observada	ES normal de la morfología celular	ES normal de la morfología celular

Discusión

El SC1 pequeñas moléculas se pueden utilizar para mantener la auto-renovación, con un estado indiferenciado de las células madre embrionarias de ratón. Antes de utilizar en una línea celular no probado, sin embargo, deben ser valorados para determinar la concentración óptima. Por ejemplo, hemos probado tres concentraciones en el ratón de células ES R1 línea ESC. 100 nm y 300 nm concentraciones fueron capaces de sostener células ES de ratón, sin embargo, una concentración de 1 M era tóxico.

SC1 también se puede utilizar bajo condiciones de alimentación libre.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
SC1	Stemgent	04-0011
LIF	EMD Millipore	ESG1107
SSEA-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	21702
Nanog antibody	Abcam	ab21603
Sox2 antibody	Chemicon International	Ab5603
Oct4 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-5279