La medición de la tensión de la membrana inducida con Di-8-ANEPPS

Resumen

Campo eléctrico externo provoca una tensión en la membrana de una célula, denominada tensión de la membrana inducida (ΔΦ). Mediante el uso de la tintura potenciométrica di-8-ANEPPS, es posible medir el ΔΦ no invasiva. Este video muestra el protocolo para la medición de ΔΦ con di-8-ANEPPS.

Resumen

La colocación de una celda en un campo eléctrico externo provoca una redistribución de carga en el interior local y exterior de la célula en los alrededores de la membrana celular, lo que resulta en un voltaje a través de la membrana. Este voltaje, llamado el voltaje de la membrana inducida (tensión inducida también transmembrana, o la diferencia de potencial transmembrana inducida) y se denota por ΔΦ, existe sólo mientras el campo externo está presente. Si la tensión de reposo está presente en la membrana, la tensión inducida superpone (agrega) en la misma. Mediante el uso de uno de los tintes fluorescentes potenciométrica, como di-8-ANEPPS, es posible observar las variaciones de ΔΦ en la membrana celular y para medir su valor forma no invasiva. di-8-ANEPPS se convierte en fuertemente fluorescente cuando se une a la bicapa lipídica de la membrana celular, con el cambio de la intensidad de fluorescencia proporcional al cambio de ΔΦ. Este video muestra el protocolo para la medición de ΔΦ con di-8-ANEPPS y también demuestra la influencia de la forma celular de la amplitud y la distribución espacial de ΔΦ.

Protocolo

Parte I: Pasos preliminares

1. En este experimento ovario de hámster chino línea celular (CHO-K1) se utiliza. Las células se colocan en Lab-Tek II cámaras (dos pozos, 4 cm ² cada uno) (Nalge Nunc, Alemania) a ~ 0.7x10 ⁵ células / ml en la HAM-F12 medio de cultivo suplementado con 8% de suero fetal bovino, 0,15 mg / ml L-glutamina, 16 mg / ml de gentamicina (todos de Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania), y 200 unidades / ml Crystacillin (Pliva, Zagreb, Croacia), y se incubaron en el 5% de CO ₂ a 37 ° C. Alternativamente, las células también pueden ser chapados en # 1 se desliza cubierta de vidrio (0,13 a 0,16 mm de espesor), recubierta con un adhesivo de celulares, tales como polilisina.
2. Se incuban las células en su medio de cultivo. La incubación dura de 2 a 4 Rendimientos horas las células que aún están más o menos esférico, pero firmemente adherida a la superficie con una pequeña parte de su membrana. Por otra parte, después de 16 a 20 horas de incubación, las células están totalmente adheridos a la superficie y tienen formas más complejas, pero la mayoría de ellos todavía no dividir.
3. Prepare una solución stock 10 mM de di-8-ANEPPS (Invitrogen, Eugene, Oregon, EE.UU.) mediante la adición de 843 l de DMSO (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) a 5 mg del colorante en el vial de Invitrogen original. La solución madre se pueden almacenar en un refrigerador a 4 ° C durante varios meses. Antes de comenzar los experimentos, calentar la solución hasta que los cristales se disuelven de DMSO.
4. Algunas líneas celulares pueden requerir el uso de Pluronic a facilitar la incorporación de contraste en la membrana celular. Pluronic se pueden comprar en solución de reserva del 20% en DMSO (F-127, Invitrogen, Eugene, Oregon, EE.UU.), o una solución de reserva de la misma concentración se puede preparar disolviendo plurónico en DMSO. Solución de archivo de Pluronic se pueden almacenar a temperatura ambiente.

Parte II: Carga de las células con di-8-ANEPPS

1. Mezcle 3 l de 10 mM di-8-ANEPPS y 2,5 l de 20% plurónico en 1 ml de la modificación Spinner (calcio agotado versión) de la SMEM medio mínimo esencial (M8167 o M4767 medio, Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania ) en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Esto produce una "solución de carga", que contiene aproximadamente 30 M-8-di ANEPPS y 0,05% de Pluronic. Para otros tipos de células, sus medios de cultivo nativo se puede utilizar en lugar de SMEM.
2. Vuelva a colocar el medio de cultivo en la cámara Lab-Tek con la solución de carga. La transferencia de la cámara a la nevera durante 10 min a 4 ° C. A esta temperatura, la internalización del colorante a través de la membrana plasmática es muy reprimidas.
3. Después de la tinción, lave el exceso de colorante dos o tres veces con SMEM puro.
4. Agregar 1,5 ml de SMEM en la cámara.

Parte III: Experimento y la adquisición de imágenes

1. Las células se observan con un microscopio de fluorescencia (en nuestro caso Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Alemania) equipado con un objetivo de inmersión en aceite (x63, NA 1.4), un VisiCam monocromador (policroma IV, Visitron, Alemania) y una cámara CCD enfriado ( 1280, Visitron, Alemania). Las imágenes se adquieren con MetaFluor 7.1.1 y procesada en MetaMorph 7.1.1 (tanto Molecular Devices, Downingtown, PA, EE.UU.), pero otro software de adquisición similar también se puede utilizar. La longitud de onda de excitación en el software de adquisición de 490 nm y elegir un filtro de emisión adecuados para ANEPPS, por ejemplo, un filtro pasa-banda centrado en 605 nm (605/55m, dicroico 565 DCXR, Chroma, Rockingham, Vermont, EE.UU.). Si un monocromador no está disponible, un filtro de excitación centrado en 490 nm se puede utilizar en su lugar.
2. Coloque la cámara con las células en el microscopio, la posición de los electrodos en la parte inferior de la cámara y su conexión con el generador de impulsos. El medio debe cubrir los electrodos.
3. Para mantener la viabilidad celular y reducir el calentamiento, el pulso debe ser de amplitud suficientemente baja y de corta duración. En este experimento, un pulso cuadrado de 35 V de amplitud y 50 ms de duración (lo suficientemente baja como para evitar la electroporación) se genera mediante una fuente de tensión continua y una medida controlado por microprocesador, el dispositivo de conmutación. Por otra parte, un generador de impulsos comerciales, tales como 33210A (Agilent, Santa Clara, CA, EE.UU.), conectado a un amplificador o un estimulador comercial, como el S88 (Grass, West Warwick, Rhode Island, EE.UU.), se puede utilizar. El pulso se entrega a dos electrodos paralelos de alambre de Pt / Ir con un diámetro de 0,8 mm y 4 mm de distancia entre ellos, creando un campo eléctrico de aproximadamente 88 V / cm entre los electrodos y ΔΦ inducción. La distribución exacta de campo entre los electrodos utilizados en este experimento es descrito en [1].
4. Encuentra las células de interés. Aplicar un pulso eléctrico o una secuencia de pulsos. Para cada pulso, la adquisición de dos imágenes de fluorescencia: una inmediatamente antes del pulso (el control de la imagen), y uno durante el pulso (la imagen de pulso). Debido a la baja respuesta de los di-8-ANEPPS, los cambios en la fluorescencia son difíciles de percibir a simple vista y llegar a ser aparente only después del procesamiento. La entrega de pulso debe estar sincronizado con la adquisición de la imagen, que es una característica de la adquisición de software. Para evitar posibles photobleaching y calefacción, la iluminación puede ser limitada a la duración del pulso.

Parte IV: El procesamiento de imágenes y análisis

1. Abra las imágenes en el software MetaMorph. Para cada pulso, restar el fondo, tanto en el control y la imagen de pulso.
2. Elegir un conjunto de células y la región de interés por lo que corresponde a la membrana. Medir la intensidad de fluorescencia a lo largo de esta región en el control de la imagen y el pulso y la transferencia de los valores de una hoja de cálculo.
3. Para cada pulso, restar los datos de control de los datos de pulso, y dividir el resultado por los datos de control para obtener los cambios de fluorescencia relativa. Si una secuencia de pulsos se aplica, los valores de los cambios relativos de fluorescencia determinada por cada pulso se promedian para obtener una medición más confiable.
4. Transformar los cambios de fluorescencia relativa a ΔΦ utilizando una curva de calibración. Una estimación aproximada de la curva se puede obtener de la literatura, pero para mayor precisión, tiene que ser medida para cada instalación en particular. Para las células y la configuración utilizada en este experimento una disminución del 6% de la fluorescencia corresponde a un incremento de 100 mV en ΔΦ [2].
5. Finalmente, grafique el voltaje en función de la longitud del arco relativa en un paquete de software de gráficos, tales como Excel (Microsoft Corp., Redmond, WA, EE.UU.), Sigma Plot (Systat Software Inc., San Jose, CA, EE.UU.), o origen (OriginLab Corp., Northampton, MA, EE.UU.). La curva también pueden ser suavizadas con un filtro adecuado, como el filtro de media móvil.

Discusión

Las mediciones de la membrana inducido (transmembrana) de tensión, ΔΦ, puede ser importante en diversos parámetros experimentales, tales como estudios de los canales de membrana voltaje-dependientes, propagación de potenciales de acción, la estimulación de células cardíacas, o la electroporación de la membrana celular [3, 4, 5, 6 , 7]. Con formas simples de células, ΔΦ se puede calcular analíticamente. Por ejemplo, para una célula esférica, ΔΦ está dada por la ecuación de Schwan s, que establece que la tensión es proporcional a la intensidad de campo y el tamaño celular y sigue a la función del coseno a lo largo de la membrana [8, 9]. Para más formas de células complicado, ΔΦ pueden desviarse considerablemente de la del coseno y debe ser determinado numéricamente, usando una computadora [2, 10, 11], o de forma experimental, utilizando un medio de potenciométrica [12, 13, 14, 15].

Uno de los colorantes potenciométricos utilizados para este propósito es di-8-ANEPPS (di-8-butil-amino-naftil-etilen-piridinio-propil-sulfonato), un tinte rápido con los espectros de excitación y de emisión depende de la tensión de la membrana, que permite que las observaciones no invasivo de las variaciones de la ΔΦ en la membrana celular y para medir su valor. En este vídeo, se muestra un enfoque experimental para la determinación de ΔΦ mediante el uso de di-8-ANEPPS.

El colorante fue desarrollado por el profesor Leslie Loew y sus colegas [13, 14] en la Universidad de Connecticut, y pertenece a la clase de respuesta rápida colorantes. di-8-ANEPPS es no fluorescente en el agua y se convierte en fuertemente fluorescente cuando se incorpora en la bicapa lipídica de la membrana celular. Un cambio en los resultados de ΔΦ en un cambio de la distribución de carga intramolecular y los correspondientes cambios en el perfil espectral y la intensidad de la fluorescencia del colorante. La intensidad de fluorescencia de di-8-ANEPPS varía proporcionalmente al cambio de ΔΦ, la respuesta de la tintura es lineal para las tensiones que van desde -280 mV a 250 mV [4, 16]. Cambios relativamente pequeños en la fluorescencia de las manchas del tinte, la membrana irregular, y la internalización de tinte que di-8-ANEPPS menos adecuados para la medición absoluta de la tensión de la membrana, por ejemplo, su componente de descanso, a pesar de estos esfuerzos también se informó [17]. Es, sin embargo, adecuada para medir los cambios más grandes en el voltaje de la membrana, tales como la aparición de la tensión de la membrana en las células no excitables inducida expuestos a campos eléctricos externos [12, 13], o potenciales de acción en las células excitables [4, 5]. Aunque no se aplica aquí, di-8-ANEPPS también permite la determinación de las mediciones ΔΦ radiométrica de excitación de fluorescencia [18] o de las emisiones [19], lo que aumenta la sensibilidad de la respuesta y reduce los efectos antes mencionados. Como di-8-ANEPPS manchas de la membrana, sino que también puede ser utilizado simplemente como un marcador de membrana [2].

Uno de los inconvenientes de la tintura es que es propenso a photobleaching, por lo que la exposición prolongada a la luz fuerte se debe evitar. La calibración de la tintura se realiza ya sea con valinomicina ionóforo (i) de potasio y un conjunto de diferentes concentraciones de potasio en el medio externo [2,18], o (ii) de patch-clamp en el modo de fijación de voltaje [17].

Finalmente, con las medidas de ΔΦ en células esféricas y las células de formas más complejas, el video muestra la influencia de la forma de la célula en la distribución espacial de la amplitud y ΔΦ. Así, por células esféricas ΔΦ está cerca de un coseno, de acuerdo con la ecuación de Schwan, mientras que para las formas más complicadas de células de la distribución espacial de ΔΦ es más complejo [20] ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
di-8-ANEPPS	Invitrogen	D-3167	potentiometric fluorescent dye
pluronic	Invitrogen	P3000MP	potassium ionophore
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
SMEM	Sigma-Aldrich	M8167 or M4767	Spinner modification of the Minimum Essential Medium
Ham-F12	Sigma-Aldrich	N4888	culture medium
fetal calf serum	Sigma-Aldrich	F4135
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
crystacillin	Pliva	625110	antibiotic
gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	antibiotic
Lab-Tek II	Nalge Nunc international	155379	chamber
DC voltage supply	Elektro-Automatik
microprocessor-controlled switcher	Custom Made
electrodes	Custom Made		Pt/Ir