Linealización del ensayo de proteínas Bradford

Resumen

La precisión y la sensibilidad de la determinación de proteínas mediante el ensayo de Bradford rápida y conveniente se ve comprometida por la no linealidad intrínseca. Se muestra un procedimiento de linealización simple que aumenta en gran medida la precisión, mejora la sensibilidad de la prueba unas 10 veces, y reduce significativamente la interferencia de los detergentes.

Resumen

Determinación de las cantidades de microgramos de proteína en el ensayo de Bradford azul brillante de Coomassie se lleva a cabo mediante la medición de la absorbancia a 590 nm. Este ensayo más común permite la cuantificación de proteínas rápida y sencilla en lisados ​​de células, las fracciones celulares, o muestras de proteínas recombinantes, con el propósito de la normalización de las mediciones bioquímicas. Sin embargo, una no-linealidad intrínseca compromete la sensibilidad y la precisión de este método. Se demuestra que bajo condiciones de ensayo estándar, la proporción de las mediciones de absorbancia a 590 nm y 450 nm es estrictamente lineal con la concentración de proteínas. Este sencillo procedimiento aumenta la precisión y mejora la sensibilidad de la prueba unas 10 veces, permitiendo la cuantificación de hasta 50 ng de albúmina sérica bovina. Además, la interferencia común introducido por los detergentes que se utilizan para crear los lisados ​​celulares se reduce considerablemente por el nuevo protocolo. Una ecuación lineal desarrollado sobre la base de la acción de masas y la ley de Beer se adapta perfectamente a los datos experimentales.

Protocolo

Linealización de la curva de calibración Bradford Proteínas:

El Coomassie brillante ensayo de la proteína azul, conocido comúnmente como el ensayo de Bradford ^1, se utiliza ampliamente debido a su protocolo rápido y conveniente, así como de su sensibilidad relativa. Desafortunadamente, no existe un alto grado de curvatura en un amplio rango de concentraciones de proteína (Fig. 1). Por lo tanto, sólo una estrecha gama de concentraciones de proteína relativamente alto, 10.2 mg / ml de BSA, se utiliza para la curva de calibración, la cual se ajusta mejor a la regresión lineal (Fig. 1, color verde). Sin embargo, la no linealidad requ....

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Discusión

El ensayo de proteínas Bradford es muy popular debido a su facilidad de realización y la sensibilidad relativa. La linealización sobre las concentraciones de proteína completa gama que se obtenga el protocolo que aquí se presenta simplifica aún más el ensayo, ya que las muestras desconocidas no tiene que estar dentro del rango de la curva de calibración.

Es importante destacar que el protocolo mejorado aún ofrece las siguientes ventajas sobre el protocolo original de Bradford:

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bradford reagent	Bio-Rad	500-0006
Bovine Serum Albumin	Amersco	0332
Multiplate absorbance reader	BioTek	Synergy2