Murino hepática Bioluminiscente modelo tumoral

Resumen

En este artículo se describe un procedimiento para la inducción de tumores en el hígado ortotópico bioluminiscentes en ratones, y el posterior análisis del crecimiento del tumor confinado al hígado, con imágenes en directo toda la luminiscencia del cuerpo.

Resumen

Este video describe la creación de metástasis hepáticas en un modelo de ratón que puede ser analizada por imágenes bioluminiscentes. Las células tumorales son administrados específicamente al hígado para provocar un tumor hepático localizado, a través de la movilización del bazo y la división en dos, dejando intacto el pedículo vascular para cada mitad del bazo. Lewis células de carcinoma de pulmón que expresan constitutivamente el gen de la luciferasa de luciérnaga (luc1) se inoculan en una hemi-bazo, que luego se resecaron 10 minutos más tarde. El otro hemisferio del bazo se mantiene intacta y se devuelve al abdomen. El crecimiento de tumores hepáticos pueden ser monitoreados por imágenes de bioluminiscencia con el IVIS todo el sistema de imagen del cuerpo. Imagen cuantitativa del crecimiento tumoral con IVIS ofrece cuantificación precisa de las células tumorales viables. La muerte celular y necrosis del tumor, debido al tratamiento farmacológico está indicado temprano por la reducción de la señal bioluminiscente. Este modelo de ratón permite investigar los mecanismos subyacentes de las células tumorales metastásicas supervivencia y el crecimiento y puede ser utilizado para la evaluación de la terapéutica de las metástasis hepáticas.

Protocolo

Introducción

El hígado suele ser el primer sitio de la enfermedad metastásica y puede ser el único sitio de difusión hasta en el 30 40% de los pacientes con enfermedad avanzada. Sin embargo, las opciones para el tratamiento de los tumores metastásicos de hígado son pocos con una minoría de los pacientes pueden someterse a resección y sólo el 23% de respuesta a los principales agentes quimioterapéuticos. La investigación preclínica en este campo ha sido limitada por la ausencia de un modelo de ratón adecuado para estudiar las enfermedades hepáticas aisladas. Se describe un planteamiento por el bazo que se puede utilizar para establecer de forma fiable metástasis uniforme, hepática difusa. La resección de la media del bazo evita las consecuencias del crecimiento del tumor esplénico y la otra mitad del bazo se devuelve con una circulación portal para mantener intactas las propiedades del bazo inmune protectora. El modelo se describe es muy sencillo de realizar y puede hacerse rápidamente a través de una sola incisión. Las propiedades luminiscentes de la línea celular tumoral permite la cuantificación exacta de la respuesta al tratamiento, sin sacrificio de los animales.

Protocolo

I. Preparación de la célula

1. Lewis células de carcinoma de pulmón se producen medio Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 10% a 37 ° C, 5% de CO ₂ y se cosechan por tripsinización cuando los sub-confluentes.
2. Las células se contaron usando un NucleoCounter (Chemo-METEC, Dinamarca) y una suspensión de células individuales de 1 x 10 ⁶ células en 200 l fue preparado en medio libre de suero.

II. Preparación del ratón

Nota: Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité de ética de la University College Cork. En nuestro laboratorio utilizamos anestésicos inyectables para anestesiar el ratón, como alternativa, se puede utilizar anestésicos inhalados para lograr el mismo efecto. La cepa de ratón que utiliza es el pelo MF1 nu / nu cepa obtenida a partir de Harlan Laboratories (Oxfordshire, Inglaterra). Mujer MF1 ratones nu / nu peso de 16-22 g, y de 6-8 semanas de edad fueron incluidos en este experimento. Otras cepas como el C57 y ratones Balb / c También se puede utilizar con las correspondientes líneas de células tumorales.

1. La anestesia fue entregado por la inyección intraperitoneal de ketamina de 1,5 mg 100 ul y 300 ug xilazina.
2. La profundidad de la anestesia se evaluó mediante una pizca dedo del pie. No debe haber ningún reflejo de retirada con el sujetador del pie.
3. El ratón anestesiado se coloca correctamente y grabó más de una almohadilla eléctrica.
4. El abdomen está preparado con una solución de Betadine al 10%.
5. El abdomen y el lugar de la cirugía están cubiertas de una manera aséptica.

III. La incisión abdominal

1. Se hace una incisión subcostal pequeña en la piel.
2. La incisión se extiende a 2-3 cm.
3. La musculatura de la pared abdominal se dividieron y entraron en la cavidad peritoneal.

IV. La exposición y la división del bazo

1. El bazo se moviliza y se exterioriza con cuidado con una gasa estéril pre-cortadas.
2. Dos ligaduras vicryl 4-0 se atan alrededor de la mitad del cuerpo del bazo.
3. Bazo se divide entre las dos ligaduras la creación de dos hemi-bazo.

V. La inyección de células en el Hemi-bazo

1. A G 27 se utiliza para inyectar un volumen de 100 l de células en una hemi-bazo.
2. Las células tumorales se permite el drenaje en el hígado durante diez minutos dando tiempo suficiente para la mayoría de las células inyectadas para llegar al hígado.

VI. La escisión de Hemi-bazo, el cierre abdominal y recuperación

1. La inyección hemi-bazo es extirpado.
2. El otro hemisferio del bazo es devuelto a la cavidad abdominal.
3. La capa muscular se cierra con sutura PDS 4-0 con una puntada simple funcionamiento.
4. La piel abdominal se cierra con prolene 4-0 con puntos sueltos.
5. Bolo se administra y la analgesia postoperatoria, Carpofen (5 mg / kg) se administra mediante una inyección IP durante 24 horas después de la cirugía.
6. El ratón se le permite recuperarse de la anestesia

VII. IVIS bioluminiscente de imágenes de cuerpo entero

1. Ratón se anestesia con anestésicos inyectables.
2. Sustrato luciferina se da por inyección intra-peritoneal diez minutos antes de imágenes
3. Los ratones son colocados en el escenario y la imagen de 3 minutos con IVIS todo el sistema de imágenes de cuerpo
4. Luminiscencia del hígado se puede medir con una región de la herramienta de interés

VIII. La exposición de hígado de ratón

1. Ratón se anestesia con anestésicos inyectables.
2. Se hace una incisión abdominal techo permite la visualización de las metástasis hepáticas difusas en vivo.
3. El ratón es la eutanasia por dislocación cervical y el hígado pueden ser extirpados para su posterior análisis.

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Figura 1. Recién extirpadas sin tratar murino y se infiltró en el tumor hígado.

Figura 2. Cinética de crecimiento de tumores hepáticos como se evidencia por imágenes IVIS todo el cuerpo.

Discusión

El desarrollo de la confianza en modelos in vivo para el estudio de las metástasis hepáticas se está convirtiendo cada vez más importante con el advenimiento de nuevas estrategias terapéuticas. Para el estudio preciso de las nuevas estrategias, modelos animales debería ser relativamente fácil de realizar, forma un importante número de metástasis, la participación de todos los pasos de la cascada metastásica, y tienen un sistema reportero que permite la detección y el recuento de un número ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Ketamine	Vétoquinol
Xylazine	Vétoquinol
Carprofen	Vétoquinol
Videne	Ecolab
Vicryl 4-0 suture	Ethicon Inc.
PDS 4-0 suture	Ethicon Inc.
Prolene 4-0 suture	Ethicon Inc.
Firefly Luciferin	Biosynth International, Inc