Modelo de isquemia cerebral focal por oclusión endovascular de sutura de la arteria cerebral media en la rata

Resumen

Inducción quirúrgica del daño cerebral isquémico en la rata es un modelo ampliamente utilizado para la investigación del accidente cerebrovascular. Aquí se demuestra la inducción de isquemia cerebral focal por oclusión de la arteria cerebral media. Visualización del infarto como resultado de la tinción histológica y la resonancia magnética también se indica.

Resumen

El accidente cerebrovascular es la principal causa de discapacidad y la tercera causa de muerte en adultos en todo el mundo ^1. En la carrera de hombres, existe un estado clínico muy variable, en el desarrollo de modelos animales de isquemia focal, sin embargo, el logro de la reproducibilidad del volumen del infarto inducida experimentalmente es esencial. La rata es un modelo animal ampliamente utilizado para el accidente cerebrovascular debido a sus costos relativamente bajos cría de animales y de la similitud de su circulación craneal a la de los seres humanos ^2,3. En los seres humanos, la arteria cerebral media (ACM) es el más comúnmente afectado por el derrame cerebral y síndromes de múltiples métodos de MCA oclusión (MCAO) se han descrito para imitar este síndrome clínico en modelos animales. Debido a que la recanalización ocurre comúnmente después de un accidente cerebrovascular agudo en la reperfusión humanos, después de un período de oclusión se ha incluido en muchos de estos modelos. En este vídeo, se demuestra lo transitorio de sutura endovascular MCAO modelo en ratas espontáneamente hipertensas (SHR). Un filamento de punta con una capa de silicio se coloca intraluminal en el origen MCA durante 60 minutos, seguida de reperfusión. Tenga en cuenta que el período de oclusión óptima puede variar en las cepas de ratas, como Wistar o Sprague-Dawley. Varios indicadores de comportamiento de accidente cerebrovascular en la rata se muestran. Isquemia focal se confirma con imágenes potenciadas en T2 de resonancia magnética y por tinción de las secciones del cerebro con cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) 24 horas después de MCAO.

Protocolo

MCAO modelo de rata

Preparación prequirúrgica

La técnica aséptica se debe utilizar para la supervivencia de todos los procedimientos quirúrgicos. Desinfectar la superficie de trabajo quirúrgico con un desinfectante comercial y preparar paquetes quirúrgicos estériles de los instrumentos, las cortinas, gasas, algodones, suturas y hojas de bisturí en autoclave. Una máscara quirúrgica, sombrero de pelo y guantes estériles deben ser usados. Un cordón seco Germinador esterilizador también se utiliza para esterilizar instrumentos quirúrgicos entre los procedimientos en caso de cirugías múltiples rata se llevará a cabo durante una sesión. Precalentar una manta homeotérmicos con camisa de agua y de lugar en una almohadilla absorbente para evitar la hipotermia de la rata durante la cirugía.

1. De manera espontánea de ratas hipertensas (o cepa de rata otros de elección) en una cámara de inducción y de inducir la anestesia con isoflurano 5% (máquina de anestesia debe ser ajustado a 1.0 L / min de O ₂ y 1,0 L / min N ₂ O). Inferior al 1-2% isoflurano para mantener la anestesia.
2. Aplique un ungüento lágrimas artificiales en los dos ojos.
3. Afeitado de la garganta y el cuello a la izquierda más allá de la zona de la incisión posibles usando las podadoras (Oster A5 con la hoja n. º 10).
4. Aplicar Betadine a una almohadilla de gasa y desinfección de la piel desde el centro de la región quirúrgica, en espiral hacia afuera. Enjuague con una gasa estéril que contiene etanol al 70%, pasando pad en un patrón similar. Repita los dos pasos para un total de tres ciclos.
5. Inyectar 0,2 ml de bupivacaína al 0.5% por vía subcutánea a lo largo del sitio de la incisión posibles.
6. Lugar de ratas en jersey estéril o la cubierta con un paño quirúrgico estéril.

Oclusión transitoria de la MCA

7. Bajo un microscopio, una incisión en la línea media ventral y se realiza disección de la fascia superficial es.
8. Debajo de la fascia superficial, a que el tejido glandular de los músculos de la izquierda y tres que forman un triángulo: el esternohioideo, que se encuentra la línea media en la tráquea, el digástrico (fácilmente identificable con su brillante porción tendinosa blanco) y, por último, el músculo esternocleidomastoideo.
9. Una cuidadosa disección aguda y roma se realiza dentro del triángulo para identificar la arteria carótida (disección roma exclusiva puede ser la preferida por algunos para minimizar los daños accidentales). Las arterias carótida externa, interna y común (ECA, ICA, CCA) están expuestos. La arteria carótida es grande y legumbres visiblemente. El nervio vago es visto circulando en la cara lateral de ambas arterias carótidas común e interna y es fuertemente diseca la arteria carótida común e interna.
10. Dos ramas de la CEPA se diseca bruscamente, la primera rama título medial y la segunda rama título lateralmente. Ambas ramas se cauterizan y corte, que permite una mayor facilidad en la movilización de los buques más grandes.
11. La CEPA está diseccionado más rostral. El hueso hioides se puedan encontrar y esto limitará la extensión de la disección rostral. La arteria carótida externa se liga lo más distalmente posible, con una sutura de seda 6-0.
12. Otra sutura de seda 6-0 se coloca libremente alrededor de la ECA, cerca de la bifurcación con la ICA. Asegúrese de no obstruir el buque, como la sutura intraluminal que se utilizará para la oclusión se va por aquí en un paso posterior.
13. Clips de microcirugía se colocan en las arterias carótidas común e interna cerca de la bifurcación.
14. Una arteriotomía parcial inicial se crea entre los dos lazos de sutura de seda en la arteria carótida externa.
15. Introducir un 2.2 -3.0 cm de longitud de la sutura de nylon monofilamento de 4-0, con una torcedura 2,0 cm de su redondeada, de silicio recubierto de punta, en la luz del Tribunal de Cuentas hacia el CCA donde se encuentra el clip de microcirugía. Estas suturas están disponibles comercialmente (Doccol Corp., Redlands, CA, EE.UU.). Cortar el resto de la ECA (en el sitio de la arteriotomía parcial) para liberar el muñón y la posición del tronco debajo de la bifurcación de la CEA y del ICA, lo que más fácilmente permiten la sutura intraluminal a deslizarse hacia el ICA.
16. Apriete la sutura de seda alrededor del muñón CEPA para asegurar la sutura de nylon intraluminal y prevenir el sangrado, y luego retire el clip microvascular de la ICA. Abra el clip lentamente antes de retirarlo para comprobar si hay sangrado.
17. Seguir avanzando en la sutura de nylon de la ECA a ICA lumen de la arteria cerebral media (ACM). Esta longitud es típicamente 18-20 mm y es la razón para la colocación de una torcedura en la sutura antes de la inserción. Después de un período variable de sutura de nylon se inserta, la resistencia se puede sentir. Si esto ocurre con gran parte de la sutura de nylon sigue presente fuera de la nave, que indica que la sutura es probable entrar en la arteria pterigopalatina (ver nota abajo). Tire hacia atrás y la curva de la sutura ligeramente para continuar por el ICA, que se desarrollará más medial. Además, la disección del origen de la PPA se puede hacer para visualizar mejor el caminodel filamento intraluminal. Seguir para insertar la sutura de nylon hasta sentir resistencia en y después de la posición de 2 cm doblado. En este punto, la sutura intraluminal ha bloqueado el origen de la MCA. MCA oclusión puede ser confirmado por el control de la reducción del flujo sanguíneo cerebral regional mediante un láser-doppler (véase la tabla de materiales para la fuente de un equipo). También tenga en cuenta que el origen de la arteria pterigopalatina fuera de la ICA puede ser directamente atado, si se prefiere, con el fin de evitar la intubación accidental de este vaso con la sutura intraluminal.
18. En marcha el cronómetro y el tiempo de registro de la oclusión de inicio.
19. Retire la microclip de la CCA.
20. Cerrar la incisión (dermis, tejido subcutáneo carnoso, las capas del tejido subcutáneo) de forma rápida con sutura de seda 3-0 (un patrón continuo simple para facilitar la reapertura de la reperfusión) y coloque cuidadosamente la rata en una jaula de recuperación. Verifique que el piso de la jaula alrededor de la nariz y la boca están libres de material de cama y seguimiento de la recuperación de la anestesia.

La restauración del flujo sanguíneo MCA (reperfusión)

21. Poco antes del período de oclusión debe terminar, vuelva a anestesiar la rata, la desinfección de la zona de la incisión con Betadine y el 70% de etanol (3 ciclos, como antes) y volver a abrir la incisión mediante la eliminación de las suturas de cierre.
22. Coloque una microclip en la CCA, como antes.
23. Retirar la sutura parcialmente oclusión de la CIA hasta el final de sutura es visible a través del ICA. NO retire totalmente de la sutura de la ICA / ECA!
24. Coloque una microclip en el ICA por encima del extremo de la sutura intraluminal.
25. Eliminar por completo la oclusión de sutura y bien atar el muñón ECA. Registro de final de la oclusión (inicio de reperfusión) tiempo.
26. Retire la microclip de la ICA.
27. Retire la microclip de la CCA.
28. Humedezca la zona con varias gotas de solución salina estéril y cerca de las capas de la incisión (dermis, tejido subcutáneo carnoso, tejido subcutáneo) con sutura de seda 3-0 con un sencillo patrón interrumpido.
29. Administrar 0,05 mg / kg de buprenorfina (u otro analgésico postoperatorio adecuado tras la directrices institucionales) en el espacio peritoneal.
30. Inyectar 5 cc de suero salino por vía intraperitoneal precalentado. Esto proporcionará la hidratación durante la etapa de recuperación.
31. Monitorear la recuperación de la rata de la anestesia.
32. Después de la rata se ha recuperado, para la indicación de la prueba de comportamiento de un infarto mediante la celebración de la rata por la cola y observando si la rata puede convertir a ambas partes. Curling a un lado sólo se espera. Escalas de puntuación simple se puede utilizar para grabar iniciales post-infarto de funcionamiento conductual (ver Discusión).
33. Inyecciones adicionales de buprenorfina (dosis igual al anterior) se debe administrar cada 6 a 8 horas durante 24 horas de alivio del dolor. Extender la analgesia si el animal muestra signos de incomodidad.

Resultados representante

Figura 1. La oclusión de la arteria cerebral media con sutura endovascular. Un diagrama simplificado del sistema circulatorio del cráneo de la rata se muestra con una sutura intraluminal de silicio recubierto ocluir el origen de la MCA. La OA y las ramas de ST de la ECA se han ligado a la izquierda y una corbata de sutura alrededor del muñón ECA tiene la sutura intraluminal en el lugar. ACA, la arteria cerebral anterior, BA, arteria basilar, CCA, la arteria carótida común, la CEPA, la arteria carótida externa, ICA, la arteria carótida interna, MCA, la arteria cerebral media, la OA, la arteria occipital, PCA, la arteria cerebral posterior; PComA, comunicante posterior arteria, PPA, la arteria pterigopalatina, ST, la arteria tiroidea superior. Figura adaptada de Sasaki et al. ⁴ y Lee ^3.

Figura 2. Representante imágenes de resonancia magnética de cortes coronales de cerebro de rata 24 horas después de una hora MCAO transitoria. Edema cerebral que acompaña la isquemia focal se visualiza en imágenes potenciadas en T2 de resonancia magnética. La zona del infarto aparece hiperintensa (brillante) en las imágenes T2. Patrones similares de infarto se puede ver con las técnicas más avanzadas, tales como resonancia magnética de difusión ponderada de imágenes y coeficiente de difusión aparente mapeo ^5.

Figura 3. Representante de las secciones coronal de cerebro de rata teñidas con TTC 24 horas después de una hora MCAO transitoria. Tinción TTC revela blanco (sin teñir) las regiones infartadas de la corteza cerebral y el estriado de la rata misma que se muestra en la Figura 2. Tenga en cuenta que el patrón general de las lesiones focales isquémica es similar a la observada en la RM en T2, aunque la zona final del infarto determinado histológicamente pueden ser ligeramente más pequeña que la lesión T2.

Discusión

Modelos de roedores de la isquemia cerebral puede ser clasificado como global o focal y reversible o irreversible. Utilizamos un modelo de isquemia focal reversible con el fin de imitar la lesión de reperfusión que puede ocurrir después de la recanalización de los pacientes con ictus humanos. Mientras que la de la rata con la ventaja de circulación similar a la del cráneo humano, la extensa circulación colateral intracraneal por el Círculo de Willis y los resultados de anastomosis leptomeníngea en los volúmenes de infarto inconsistente ^6. Usamos la ratas espontáneamente hipertensas (SHR) tensión porque el tamaño del infarto es mayor en SHR expuestos a la isquemia cerebral focal en comparación con las ratas normotensas ^70-10. Inducción de accidente cerebrovascular en SHR también es más consistente y puede generar menos mortalidad que en otras cepas de uso común ^11. Además, los parámetros fisiológicos deben ser controlados a través de la cirugía, debido a las fluctuaciones pueden añadir a la variabilidad en los volúmenes de infarto, estos parámetros incluyen la presión arterial, arterial de O ₂ y CO _2, la hipotermia y la hiperglucemia, que puede agravar la lesión isquémica ^2,12 . La hipotermia es motivo de especial preocupación, ya que puede disminuir el grado de la lesión isquémica neuronal, y por lo tanto, la colocación de la rata en una almohadilla eléctrica de termorregulación durante la cirugía es esencial.

Contamos con preparados comercialmente de silicio recubierto suturas en este procedimiento en un intento de aumentar la coherencia en el tamaño del infarto ^13-15. Tradicionalmente, los puntos de sutura intraluminal utilizados para ocluir la MCA han sido preparados por una llama redondeo 3-0 punta de sutura de nylon o con una pistola de pegamento caliente para cubrir la punta de la sutura con una pequeña gota de pegamento ^16. Estos procedimientos producen las suturas con diámetros de punta diferentes y por lo tanto, puede requerir varios intentos antes de encontrar la oclusión de una sutura que coincida con el diámetro de los vasos de una rata dado. Otras variaciones en el método descrito en este MCAO de vídeo incluyen la oclusión más distal, evitando las ramas lenticuloestriadas con el fin de tener un infarto cortical pura ^17, y la oclusión simultánea de la MCA y ipsilateral arteria carótida común para reducir el flujo sanguíneo colateral ^6,9.

Los efectos funcionales de accidente cerebrovascular puede ser evaluada utilizando una variedad de pruebas de comportamiento, en la que los déficits en las tareas específicas se reflejan en una escala de puntuación simple. Por ejemplo, Bederson et al. ¹⁸ ratas desarrollaron una puntuación neurológica clasificación del grado de flexión de la extremidad anterior en una posición elevada del cuerpo, resistencia asimétrica a un empuje lateral y el comportamiento en campo abierto en círculos. Las ratas se extiende tanto a las extremidades anteriores al suelo cuando elevada y que no presentan otras deficiencias se calificaron "Normal (0)", mientras que las ratas con la flexión de miembro superior contralateral sólo fueron clasificados con "déficit moderado (1)". "Grave grado 2" ratas muestran disminución de la resistencia en el lado contralateral a una fuerza lateral y "severo grado 3", las ratas, además, participan en círculos comportamientos. Déficits conductuales menor grado se observó siempre en el grado inmediatamente superior (por ejemplo, grado 2 y 3 animales también se muestra la flexión de miembro superior), y estos resultados fueron predictivos de las diferencias en el tamaño del infarto ^18. Por lo tanto, como un sencillo sistema de puntuación permite una rápida y consistente semi-cuantitativos de evaluación de los déficits funcionales de un accidente cerebrovascular.

La medición de la extensión del infarto cerebral que comúnmente se logra mediante tinción histológica del daño tisular utilizando TTC, cresil violeta (Nissl mancha) o hematoxilina y eosina. Técnicas de imagen por resonancia magnética, incluyendo RMC difusión para visualizar el infarto en los puntos de los primeros tiempos después de la oclusión, que permitan la determinación de un volumen del infarto en ratas cada individuo sin la necesidad de cosechar los tejidos. Esto es especialmente valioso en los estudios dirigidos a determinar la eficacia de un tratamiento neuroprotector después del accidente cerebrovascular; imagen de la rata después de MCAO pero la administración antes del tratamiento da la confianza de investigador que todos los animales experimentales y de control con experiencia trazos similares a los de inicio, la reducción de los efectos de confusión de la variabilidad en la inducción de un derrame cerebral.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon suture	Doccol Corporation		2-3 mm silicon coating length, 0.39 mm tip diameter
Spontaneously hypertensive rats	Charles River Laboratories		290-300 g, male
Gaymar T/Pump thermoregulatory pump and pads	Gaymar Industries
Vetroson V-10 bipolar electrosurgical unit	Summit Hill Laboratories
Germinator 500 glass bead sterilizer	CellPoint Scientific
Vasamedics Bpm2Laserflo blood perfusion monitor	TSI Inc.