Estudio de células gliales Influencia heterogeneidad de crecimiento de los axones se utiliza un método co-cultivo de Nueva

Resumen

En este protocolo, que describe un nuevo método para estudiar la influencia de la heterogeneidad de las células gliales en el crecimiento del axón con una In vitro Co-cultura del sistema. Rata células gliales corticales se cultivaron hasta la confluencia con cocultured y altamente purificado rata dorsal neuronas de los ganglios de la raíz. Influencia de diferentes células de la glía en la adhesión de las neuronas y crecimiento de los axones se comparó directamente en la misma cultura. Este método proporciona una nueva forma de estudiar directamente la influencia de células gliales heterogeneidad en la adhesión neuronal y el crecimiento del axón.

Resumen

En el sistema nervioso central de los mamíferos, axones dañados después de una lesión no son capaces de regenerar a sus objetivos originales y la recuperación funcional es muy pobre ^1. El fracaso de la regeneración axonal es el resultado combinado de varios factores, incluyendo el ambiente hostil de células gliales, las moléculas inhibidoras de mielina y disminución de la relación intrínseca capacidad de regeneración de las neuronas ^2. Los astrocitos son el tipo de células gliales más predominante en el sistema nervioso central y desempeñan un papel importante en las funciones del axón en la fisiología y la patología de condiciones ^3. A diferencia de los oligodendrocitos homólogos, los astrocitos son una población celular heterogénea compuesta por diferentes sub-poblaciones de astrocitos con diversas morfologías y la expresión génica ^4. La importancia funcional de esta heterogeneidad, como su influencia en el crecimiento axonal, es prácticamente desconocida.

Para el estudio de las células gliales, especialmente la función de la heterogeneidad de los astrocitos en el comportamiento de las neuronas, que estableció un nuevo método de cultivo de alta co-purificado neuronas raíz dorsal ganglios con células gliales obtenido de la corteza cerebral de rata. Mediante esta técnica, hemos sido capaces de comparar directamente la adhesión neuronal y el crecimiento de los axones en las subpoblaciones astrocitos diferentes en las mismas condiciones.

En este informe, le damos el protocolo detallado de este método para el aislamiento de los astrocitos y la cultura, los ganglios de la raíz dorsal neuronas aislamiento y purificación, y el co-cultivo de neuronas DRG con los astrocitos. Este método también podría extenderse a otras regiones del cerebro para estudiar la interacción celular específica o regionales entre las neuronas y células gliales.

Protocolo

1. Cultivo de células glía

Las células gliales pueden ser cultivadas de diferentes regiones del sistema nervioso central. Todo el proceso se muestra en la figura del proceso.

Día 1 de recubrimiento placa de cultivo y cubreobjetos

1. Seco ronda esterilizados cubreobjetos de vidrio para microscopio en un autoclave.
2. La placa cubreobjetos esterilizados en la placa esterilizada cultivo de 24 pocillos.
3. Cubra el cubreobjetos con poli-lisina y se incuba durante 2 horas a temperatura de la raíz.
4. Escudo de 6 y placas de cultivo de la misma manera que en el paso 3.
5. Lave el cubreobjetos y 6-así placa de cultivo de dos veces con agua destilada y secar al aire en el capó cultura.
6. Añadir 200 l medio DMEM (con 10% de SFB) en cada pocillo de 24 y placa y 2 mL en cada pocillo de 6 pocillos y ponerlos en la incubadora por debajo de 37 grados con 5% de CO ₂

Día 2 corteza de aislamiento y cultivo de células gliales

1. Esterilizar la campana de flujo positivo de disección.
2. Encienda la luz UV durante 20 minutos.
3. Rocíe todas las superficies con alcohol al 70% y esperar 15 minutos antes de su uso.
4. cambian de tiempo: las crías de rata Anestesie (P2-P6) por hipotermia, y decapitar a la base de la magna framen con unas tijeras de operación.
5. Abrir el cráneo a lo largo de la sutura sagital con una tijera iris y se desprenda del cráneo.
6. Quitar el cerebro anterior y ponerlos en frío L15, bajo microscopio estereoscópico, limpiar cuidadosamente la membrana dura y pia con los vasos sanguíneos, aislar la corteza y lavar varias veces con medio L15.
7. Cortar la corteza en trozos pequeños con tijeras de microcirugía.
8. Agregar 0,125% de tripsina-EDTA preparada con medio L15 en pedazos la corteza y se incuban en 37 grados durante 15 minutos.
9. Transferencia de bloques de tejido en 20 ml de medio DMEM con FBS al 20% en 50 ml de tubo, agregar la solución de DNasa acciones a 10ug/mL concentración final, se aspira la solución de los tejidos arriba y hacia abajo durante 20 horas con el fuego cristal pulido Pasteure pipeta, recoger la suspensión de células individuales.
10. Lave la suspensión de células una vez con medio DMEM, volver a suspender las células en DMEM con FBS al 10%, recuento de células bajo el microscopio de las células de las semillas con un hemocitómetro, en 5000-10000/cm ^2. Mantener las células en un incubador de grado 37 5%, el cambio de la mitad de la media dos veces por semana.

2. Ganglios dorsales neuronas raíz Aislamiento, cultivo y purificación

Día 1 Prepare Cultura Material

1. Cubra el cubreobjetos esterilizados con poli-lisina cubreobjetos de lavado, dos veces con destilar el agua y el aire seco, ponerlos en placas de 24 pocillos.
2. Añadir medio Neurobasal 100μL con un 2% B27 y 2.5S NGF (50 ng / ml), se puso la placa en 37 grados de CO _{2 al} 5%.

Día 2 Aislar GRD a partir de embriones

1. Esterilizar la campana de flujo en la misma forma que el cultivo de células gliales.
2. La eutanasia a una rata preñada (E15) por sobredosis de CO _2, el abdomen esterilizados en un 70% de etanol, los embriones fueron aisladas de útero y la puesta en frío L15.
3. Aislar a la médula espinal con los ganglios de la raíz dorsal conectada en microscopio estereoscópico y la transferencia a los platos refrigerados de 35 mm con medio L15.
4. Recoger única suspensión de células y lavar una vez con NBF medio (medio Neurobasal contiene 2% de B27 y 2.5S NGF (50 ng / ml)).

Día 3 Purificar neuronas DRG

1. 18h-24h después de la siembra de neuronas, añadir un 1 mM de solución concentrada de acciones FUDR a la cultura de las neuronas a una concentración final de 20 my un volumen final de 200 mL.
2. 72 horas más tarde, reemplace la mitad de la media con medio Neurobasal contiene 2% de B27 y 2.5S NGF (50ng/mL) sin FUDR. Después de eso, el cambio del medio día por medio.

3. Cocultivo neuronas DRG con las células gliales

1. Cuando el cultivo de células gliales llegó a la confluencia (alrededor de 20 días después de la siembra), que estaban listos para co-cultivo con las neuronas.
2. 24 horas antes de la adición de las neuronas purificadas, las células gliales medio se cambió a medio Neurobasal contiene 2% de B27 y 2.5S NGF (50 ng / mL).
3. Neuronas purificada fueron recolectadas en pozos cultura, la suspensión células individuales se obtiene al pasar a través de una pipeta mecánica Pasteure pulidas al fuego.
4. Después de contar el número, las neuronas se sembraron a 500/cm ² en las células gliales confluentes en un medio de Neurobasal contiene 2% de B27 y 2.5S NGF (50ng/mL).
5. Adhesión de las neuronas y el crecimiento de las neuritas en las células gliales pueden ser registrados y analizados en diferentes momentos por el software de análisis de imagen y inmunocitoquímica, utilizando anticuerpos tipo de células específicas.

4. Resultados representante

1. Cultivo de células gliales: Después de la siembra, las células gliales que confluyen alrededor de 20 días. Bajo microsc de contraste de faseopa, que se puede identificar fácilmente que las diferentes subpoblaciones de células gliales forman morfológicas diferentes subestructuras patrón de crecimiento y los astrocitos GFAP positivos representaron más del 90%, como se muestra mediante la técnica de immuocytochemisty (Figura 1, Figura 2).
2. DRG neuronas cultura: En este método, después de 72 horas de tratamiento FUDR, la pureza de las neuronas DRG llegará tan alto como 99% en los 6 días, las neuronas DRG mostró sus morfologías únicas y con un alto crecimiento de neuritas densidad (Figura 3, Figura 4).
3. Co-cultivo de células gliales y las neuronas: las neuronas DRG adherencia y crecimiento de las neuritas se produjo con facilidad en las células gliales en las 4 horas después de la siembra, la observación cuidadosa mostró que la adhesión neuronal y el crecimiento de las neuritas se vieron influidos por las subpoblaciones de células gliales, que forman especiales subestructuras patrón de crecimiento, esto podría ser fácilmente identificados bajo el microscopio de contraste de fase y por inmunocitoquímica (Figura 5, Figura 6).

Figura 1. Morfología de las células gliales confluentes. Cortical células gliales se chapada en cubreobjetos recubiertos polilisina y se cultivaron durante 20 días, tenga en cuenta el patrón de crecimiento diferente de las células gliales, las células en la parte izquierda dispuestos en forma radiada.

Figura 2. Confluente células gliales marcado por proteína ácida glial fibrilar (GFAP) de anticuerpos. Tenga en cuenta la disposición emitida por GFAP (rojo) células positivas en el lado derecho.

Figura 3. Neuronas dorsales ganglios de la raíz crecieron in vitro sin necesidad de tratamiento FUDR. La contaminación de las células formadas DRG fondo de las neuronas.

Figura 4. Neuronas dorsales ganglios de la raíz crecieron in vitro después del tratamiento FUDR. Las células de fondo contaminantes se había eliminado por completo.

Figura 5. Neuronas dorsales ganglios de la raíz cultivada en células gliales. Adherencia y crecimiento de las neuritas neuronas se inhibieron en las células radiadas organizado y limitado en las células gliales lado derecho.

Figura 6. Neuronas dorsales ganglios de la raíz que crece en las células gliales marcado por anticuerpos neurofilamentos. El neuritas (verde) se inhibió en la radiación dispuestos células gliales lado izquierdo y limitada en el lado derecho, todas las células gliales se marcaron con anticuerpos GFAP (rojo).

Discusión

Este protocolo experimento fue diseñado para alcanzar dos metas para estudiar las células gliales, la influencia de la heterogeneidad, especialmente los astrocitos en la adhesión neuronal y el crecimiento de las neuritas. El primer objetivo era mantener la heterogeneidad de los astrocitos en lo posible, en este experimento, la confluencia de las células gliales cultura astrocitos enriquecido se mezcla la cultura primaria sin ningún tipo de tratamiento químico y la propagación de la digestión, lo cual puede daña...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM(high glucose)	Invitrogen	10313-039
L15 medium	Invitrogen	11415-114
FBS	Invitrogen	10437-077
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103-049
poly-lysine	Sigma-Aldrich	P4832	culture grade
NGF(2.5S)	Invitrogen	13257-019
B27 supplyment	Invitrogen	17504-044
0.25% trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503
neurofilament antibody	Abcam	ab24575