Preparación de inmunógeno ratón hipófisis para la inducción de la hipofisitis autoinmune experimental

Resumen

Hipofisitis autoinmune se puede reproducir en ratones mediante la inyección de un extracto de proteínas de ratón pituitaria.

Resumen

Hipofisitis autoinmune es una inflamación crónica de la glándula pituitaria causado o acompañado por ^una autoinmunidad. Tradicionalmente se ha considerado una enfermedad rara, pero la información se ha incrementado notablemente en los últimos años. Hipofisitis, de hecho, no es raro desarrolla como un "efecto secundario" en pacientes con cáncer tratados con anticuerpos que bloquean los receptores inhibitorios expresa en los linfocitos T, tales como CTLA-4 ² y los receptores de PD-1. Hipofisitis autoinmune puede ser inducida experimentalmente mediante la inyección de ratones con las proteínas de la hipófisis se mezcla con un adyuvante ^3. En este artículo de vídeo que muestra cómo extraer las proteínas de ratón glándulas pituitaria y la forma de prepararlos de forma adecuada para la inducción de hipofisitis autoinmune en ratones SJL.

Protocolo

Protocolo experimental

El primer paso de este protocolo experimental es recoger un gran número de glándulas pituitarias de ratón. El segundo paso consiste en homogeneizar las glándulas para preparar un extracto de proteínas. El tercer paso es para emulsionar estas proteínas con una mezcla de hidrocarburos.

Paso 1: Recolección y almacenamiento de ratón glándulas pituitarias

La glándula pituitaria del ratón se encuentra en la base del cráneo en una depresión del hueso esfenoides llamada silla turca, rodeada lateralmente por los nervios trigémino y anteriormente por el quiasma óptico. La glándula está compuesta de un lóbulo anterior más grande y más pequeño lóbulo posterior y medio, y pesa un promedio de 1,9 mg. La glándula pituitaria son recogidos de los ratones de cepas mixta, sexos, edades, y destinado a ser sacrificado por el centro de atención animal.

Para aislar la glándula pituitaria, el ratón es la eutanasia, la piel sobre el cráneo disecado, y el hueso del cráneo a cielo abierto con unas tijeras. El cerebro se levanta para exponer la glándula pituitaria, la cual es entonces aislado de los alrededores de la duramadre, recogió del hueso esfenoides y se almacena en un tubo de plástico con hielo seco.

En general, se utilizan 300 glándulas pituitaria del ratón para la preparación de una proteína, un número que puede ser recogido por una persona en 9 horas.

Una vez que la colección se completa, el tubo que contiene las glándulas pituitarias se almacenan a -80 ° C hasta que esté listo para el siguiente paso.

Paso 2. La extracción de las proteínas del ratón pituitaria

1. Añadir el tampón de homogeneización a un tubo Falcon de 15 ml (catálogo no 352.059), mantenidos en un baño de hielo, con 250 l de tampón por cada 100 glándulas pituitarias recogidos. Utilice un tampón de fuerza iónica similar a la que es fisiológicamente el interior del citoplasma de la célula (0,2 M) y de pH fisiológico (7,4). Usamos tampón fosfato salino (0,161 M, pH 7,4), complementado con un cóctel de inhibidores de la proteasa (Sigma-Aldrich, el catálogo no P8340-1 ml).
2. Añadir la glándula pituitaria en el búfer antes de la homogeneización, y luego colocar el generador (5 mm de diámetro) de la homogeneizador Polytron en la parte inferior del tubo Falcon. Homogeneizar a máximas rpm durante 30 segundos, moviendo suavemente el tubo Falcon arriba y hacia abajo mientras lo mantiene en el baño de hielo. Luego, el resto del homogeneizado en hielo durante 1 min. Repita la homogeneización y refrigeración pasos dos veces más. Esta homogeneización suave debe romper las células y liberar las proteínas citosólicas sin interrumpir los núcleos.
3. Para eliminar los núcleos, el tejido roto y materiales insolubles (por ejemplo, tejido conectivo y los complejos de proteínas desnaturalizadas), se centrifuga el homogeneizado a baja velocidad (1000 g) durante 10 min a 4 ° C.
4. Transferir el sobrenadante (que ahora se llama post-nuclear sobrenadante, PNS) a un nuevo tubo Falcon, teniendo cuidado de dejar la bolita sin tocar, y almacenar el SNP en el hielo.
5. Resuspender el precipitado en el volumen original de tampón de homogeneización (250 l de tampón por cada 100 glándulas pituitarias recogidos), homogeneizar el anterior, se centrifuga como antes, y luego combinar el SNP segundo con el primero.
6. Alícuota de los dos combinados PNS muestras en tubos de microcentrífuga y se almacena a -80 ° C hasta que esté listo para el siguiente paso. Esta preparación de proteínas puede ser almacenado a -80 ° C, pero poco a poco pierde su potencia, lo que se recomienda para utilizar antes de 6 meses a partir de la preparación. Use una pequeña alícuota para determinar el rendimiento de proteína y la concentración por el ensayo BCA (Pierce catálogo no. 23.225), y la calidad de las proteínas por electroforesis en gel. En general, se obtienen alrededor de 60 mg de proteína de 300 hipófisis de ratón en 1,5 ml de tampón de homogeneización, a una concentración de alrededor de 40 mg / ml.

Paso 3. Preparación de la emulsión para la inmunización

1. Descongele rápidamente las alícuotas congeladas proteína necesaria para el experimento y ajustar la concentración de proteínas y 20 mg / ml. Este extracto de proteínas se emulsiona 1:1 con adyuvante completo de Freund (CFA, Sigma F-5881) que contiene 5 mg / mL de calor mató a Mycobacterium tuberculosis (Becton Dickinson, 231 141). Cada ratón recibirá 1 mg de extracto de pituitaria en 100 L de la emulsión.
2. El ejemplo anterior es para inmunizar a 10 ratones, en la que cada ratón inyectado con 100 L de la emulsión que contiene 1 mg de proteínas de la hipófisis. Permitir que dos ratones más por la pérdida de material durante la preparación, a fin de utilizar 12 mg de proteínas de la hipófisis. Aspire 600 l de los 20 mg / ml de extracto de proteína de la pituitaria anterior describe con una jeringa de 2,5 ml Hamilton gas. Resuspender el Comité de Libertad Sindical por agitación, y aspiran 600 l de CFA en otra jeringa de 2,5 ml Hamilton. Adjuntar y asegurar una de calibre 22 micro-emulsión aguja en la jeringa llena de CFA. Empuje lentamente el émbolo de la jeringa CFA de tal manera que la aguja está lleno de CFA, a continuación, colocar y fijar el otro extremo de lala aguja de la jeringa llena con extracto de pituitaria.
3. Avanzar lentamente el émbolo de la jeringa CFA para impulsar el componente de aceite en el extracto acuoso pituitaria, de tal manera que sólo una pequeña cantidad se mezcla. A continuación, empuje el émbolo de la jeringa extracto de pituitaria en la jeringa CFA. Repita esta acción aumentando gradualmente la cantidad de material mezclado. Continúe hasta que todo el contenido de las dos jeringas se mezclan. Usted obtendrá una solución blanquecina y uniformemente distribuida que representa la emulsión de agua en aceite.
4. Una vez que la emulsión se forma, repita el movimiento hacia adelante y hacia atrás por lo menos 500 veces para asegurarse de que la emulsión se mezcla bien. Después de que el ciclo de mezclado final, la 1:01 de agua en emulsión de aceite está listo para usar y contiene una concentración de proteína pituitaria de 10 mg / ml. La emulsión se inyectó el mismo día por vía subcutánea en ratones anestesiados SJL, como se detalla en el artículo JoVe compañero.

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Discusión

A pesar de que el primer paciente con hipofisitis autoinmune se informó en 1962 ^4, los autoantígenos patógenos hipófisis aún no se han identificado ^5. Los modelos animales pueden ser muy útiles para identificar a estos autoantígenos, ayudar al descubrimiento de biomarcadores que son traducibles al cuidado del paciente. Este artículo ha demostrado un procedimiento sencillo para la preparación de proteínas de la hipófisis en una forma que es adecuada para la inducción de hipofisitis autoi...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15-ml Falcon tubes
homogenization buffer
phosphate buffered saline
protease inhibitor cocktail
Polytron homogenizer
BCA assay	Pierce, Thermo Scientific	23225
Complete Freund’s Adjuvant (CFA)	Sigma-Aldrich	F-5881
Mycobacterium tuberculosis	BD Biosciences	231141
2.5 mL Hamilton gastight syringe
22-gauge micro-emulsifying needle