Marcado específico del VIH-1 células positivas utilizando un vector lentiviral Ap-dependientes que expresan la proteína verde fluorescente

Resumen

Hemos desarrollado un vector lentiviral que posee, además de la LTR-Tat respuesta, el elemento de respuesta Rev (RRE) que pueden regular la expresión del gen de una forma del VIH-1 Tat y Rev-dependiente. El vector permite la detección específica de la replicación del VIH en las células vivas a través de la expresión de GFP.

Resumen

La mayoría de los vectores de la expresión del VIH-respuesta se basan en el promotor del VIH, la repetición terminal larga (LTR). Mientras que responda a una de las primeras proteínas del VIH, Tat, el LTR es también sensible a los estados de activación celular y la actividad de la cromatina local, donde la integración se ha producido. Esto puede resultar en altas tasas de VIH-independiente de la actividad, y ha limitado la utilidad de la LTR basado en reportero para marcar las células con VIH ^1,2,3. Aquí se construyó un vector de expresión lentiviral que posee, además de la LTR-Tat respuesta, numerosas secuencias de ADN del VIH que incluyen el elemento Ap-respuesta y los sitios de empalme VIH ^4,5,6. El vector se incorporó a un reportero lentiviral virus, lo que permite una detección muy específica de la replicación del VIH en las poblaciones de células vivas. La actividad del vector se mide por la expresión de la proteína de fluorescencia verde (GFP). La aplicación de este vector como se informó aquí ofrece un enfoque alternativo nuevo a los métodos existentes, como la PCR in situ o tinción del antígeno, para identificar el VIH de células positivas. El vector también puede expresar genes terapéuticos para la experimentación básica o clínica para orientar el VIH de células positivas.

Protocolo

1. La transfección de plásmidos para la producción de las partículas lentivirales Ap-dependiente

Set up: The Rev-dependiente GFP vector lentiviral, PNL-GFP-RRE-SA, se ha descrito anteriormente ^4,5,6. Para montar en una partícula viral, el plásmido se contransfected en HEK293 células T con un VIH-1 en la construcción de envases, pCMVΔ8.2 (amablemente proporcionados por el Dr. Dider Trono), y un plásmido que lleva la glicoproteína VSV-G (pHCMV-G) . La transfección se realizó mediante el método de fosfato de calcio.

Preparación de tampones: 10 X HBS (Hepes salina tamponada) se preparó disolviendo 5 g de Hepes, 8 g de NaCl, 0,37 g de KCl, 1 g de dextrosa, 0,103 g de Na ₂ HPO ₄ (anhidro) en 100 ml de H ₂ O. Alícuota the10 X EPF buffer en alícuotas de 1 ml y almacenar a -20 ° C. En el momento de la transfección, convertir el 10 X 2 X HBS para HBS con H ₂ O (1: 5 de dilución), y ajustar el pH entre 7,05 a 7,12. (De 10 ml de HBS 2 X, por lo general requiere de aproximadamente 50 l de NaOH 1M). Filtro de esterilizar el 2X tampón HBS, al pasar por un filtro Millipore de 0,22 M. CaCI buffer ₂ se realizó mediante la disolución de CaCl ₂ en 10 mM Hepes a una concentración final de 2 millones. Ajustar el pH a 5.8, filtro de esterilización de la memoria intermedia y se almacenan a 4 ° C.

Procedimiento:

1. Un día antes de la transfección, las semillas de 2 x 10 ⁶ células HEK293T en una de 100 mm de Petri plato, y hacer crecer las células durante la noche en 10 ml de DMEM + 10% de SFB a 37 ° C, 5% de CO _2.
2. Al día siguiente, retirar el sobrenadante de las células y reemplazar con 5 ml de DMEM + 10% de SFB, continuamente células en cultivo durante 4 horas.
3. En un tubo de poliestireno de 5 ml, añadir 480 l 2X tampón HBS.
4. En un segundo tubo de poliestireno de 5 ml, añadir 60 l 2 M _de CaCl2 buffer, el ADN del plásmido y transfección buffer TE (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8,0) hasta un volumen total de 480 mL. Para cada plato de Petri, los plásmidos se debe agregar en la proporción de 10 mg de PNL-GFP-RRE-SA, 7,5 g de pCMVΔR8.3, y 2,5 mg de pHCMV-G.
5. Añadir el plásmido _ADN-CaCl2 mezcla gota a gota en el tubo de 2 X HBS, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Un fino precipitado se forma.
6. Agregue el l 960 de la mezcla gota a gota con una pipeta a las células. Se incuba a 37 ° C CO, 5% ₂ durante la noche.
7. Al día siguiente, separar el sobrenadante y agregar 10 ml DMEM + 10% de SFB, y continuamente se incuban las células a 37 ° C CO, _5% de CO2 durante la noche.
8. A las 48 horas después de la transfección, la cosecha del virus mediante la eliminación del sobrenadante y transferirlo en tubos de 50 ml estériles. Añadir nuevo 10 ml fresca FBS DMEM + 10% en cada plato de Petri y siguen a la cultura durante la noche. Guardar el sobrenadante del virus a 4 ° C.
9. Continuar la cosecha de 72 horas después de la transfección mediante la recolección del sobrenadante. Combine todos los sobrenadantes y centrifugar el sobrenadante a 500 xg durante 15 minutos para sedimentar y eliminar los desechos celulares.
10. El sobrenadante se recogieron y se filtra a través de un filtro Millipore de 0,22 M. El virus se concentró aún más a través de columnas de exclusión de tamaño.

2. Concentrar las partículas virales y determinar título viral

1. Las partículas virales se concentraron por una columna de exclusión por tamaño (100.000 MW cortado, Centricoin). Sobrenadante viral se ha cargado en la columna, y se centrifuga a 6000 xg a 4 ° C durante 15 minutos.
2. Sobrenadante viral concentrada se recogió, alícuotas, y almacenadas a -80 ° C.
3. El título viral se determinó por la infección de un TNF-tratamiento, el VIH-1 positivos línea celular chaqueta, J1.1 7. Las células fueron cultivadas en una placa de 96 pocillos de 2,5 x 10 ⁵ células por ml (100 ml de volumen total), e infectados con 100 ml de diluciones seriadas VNL-GFP-RRE-SA por una semana. El título (TCID50) de la partícula se calculó contando los pozos GFP positivos siguiendo el método de Reed y Muench 8.

3. Marcando el VIH-1 células positivas con la partícula lentivirales, VNL-GFP-RRE-SA

Montaje: una T CD4 líneas de células humanas, CEM-SS, estaba infectado primero con el VIH-1. A las 48 horas post-infección, las células fueron superinfección con las partículas lentiviral, VNL-GFP-RRE-SA. Después de la sobreinfección por otros dos días, las buenas prácticas agrarias de células positivas fueron analizadas por citometría de flujo. Como control, el VIH-1 no infectadas CEM-SS células fueron infectadas con idéntica VNL-GFP-RRE-SA. Sólo la pandemia del VIH-1-infected CEM-SS células dieron lugar a las células GFP positivos, pero no el VIH-1 no infectadas CEM-SS células.

Procedimiento:

1. Dos horas antes de la infección, añadir polybrane a una concentración final de 4 mg / mL. Recuento de células y tomar 2 x 10 ⁵ células por cada infección. Infectar a las células con 200 ng (p24) del VIH-1 _NL4-3 durante 2 horas.
2. Lavado de las células por centrifugación a 300 xg durante 10 minutos, resuspendercélulas en 2 x 10 ⁵ células / ml, y la cultura a 37 ° C durante 48 horas.
3. Recuento de células y tomar 2 x 10 ⁵ células por la infección por VNL-GFP-RRE-SA. Añadir 100 ml de VNL-GFP-RRE-SA y se incuba a 37 ° C durante la noche. Lavar las células y resuspender en 2 x 10 ⁵ células / ml.
4. Realizar un análisis de citometría de flujo a las 48 horas después de la superinfección. Las células infectadas se sedimentaron y se resuspendieron en 500 ml paraformaldehede 1%, incubados a temperatura ambiente durante 20 minutos, y luego se analizaron en un analizador FACScan (Becton Dickenson).

4. Resultados representante

Si los experimentos se realizó con éxito, una población considerable GFP se detectó en el VIH-1-infected CEM-SS células por el citómetro de flujo, mientras que, en el control, las células GFP positivos no se detecta el VIH-1 no infectadas CEM-SS las células.

Si los experimentos se realizó con éxito, el vector lentiviral Ap-dependiente, VNL-GFP-RRE-SA, permitirá una detección muy específica de la replicación del VIH en las poblaciones de células que viven, a través de la medición de la proteína verde fluorescente (GFP) de expresión. En este ejemplo, se recogieron CEM-SS células fueron teñidas con un anticuerpo marcado con PE rata monoclonal contra CD24 de ratón, HSA, y luego se analizaron en un citómetro de flujo, tanto para la HSA y la expresión de GFP.

Figura 1. Como se muestra aquí, una población considerable GFP se detectó en el VIH-1 las células infectadas por superinfección con VNL-GFP-RRE-SA (Figura 1c). En contraste, las células GFP positivos no se han detectado, ya sea en el VIH-1 no infectadas CEM-SS células sin sobreinfección lentiviral (Figura 1a) o el VIH-1 las células no infectadas con sobreinfección lentiviral (Figura 1b).

Discusión

Al igual que con los vectores de expresión antes desarrollado Tat-dependientes, el sistema de Apocalipsis se describe aquí es una explotación de un proceso de evolución del VIH. La inclusión de Rev-dependencia hace que el vector de expresión basado en LTR depende en gran medida la presencia de la replicación del VIH. La aplicación de este vector como se informó aquí, un reportero de virus VIH-dependiente, ofrece un nuevo enfoque nuevo para identificar el VIH de células positivas. El vector permite el examen de las células vivas, se puede expresar cualquier gen para la experimentación básica y clínica, y como un lentivirus pseudo-tipo tiene acceso a más tipos de células y tejidos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety Cabinet
37°C 5%CO2 incubator
Flow cytometer		FACSCalibur
Centrifuge	Beckman Coulter Inc.	Allega®6KR
4°C regrigerator
-20°C refrigerator
-80°C refrigerator
Cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer® AutoT4
HEK293T cell line	National Institutes of Health
CEM-SS cell line	National Institutes of Health
Jurkat cell line J1.1	National Institutes of Health
DMEM	Invitrogen	11965-118
RPMI 1640	Invitrogen	21870
HI FBS	Invitrogen	10438-018
HIV-1NL4-3			prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA
pNL-GFP-RRE			copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3
pNL-GFP-RRE-SA			Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE
pCMVΔ8.2			provided by Dr. Dider Trono
pHCMV-G
10 x HBS (Hepes Buffered Saline)	Invitrogen	11344-041
2M CaCl2 buffer	Invitrogen	S-013-154-10
1% paraformaldehy	Sigma-Aldrich	158127
Bleach
50ml Falcon tubes	BD Biosciences	358206
5ml round bottom tubes	BD Biosciences	352063
0.45μM Millipore filter	EMD Millipore	SLHA033SS
0.20μM Millipore filter	EMD Millipore	SLFG85000
100mm Petri-dish	Sigma-Aldrich	CLS430588
Size-exclusion column (100,000MW cut off)	Sartorius AG	VS2041
2ml frozen tube	Axygen Scientific	SCT-200
96-well plate	BD Biosciences	353227
1.7mL Microcentrifuge Tube	Axygen Scientific	MCT- 175-C