Protocolo para las infecciones de dengue en mosquitos (Aedes aegypti) y determinación de fenotipo infección

Resumen

Una vez que un gen es identificado como potencialmente resistente a los virus del dengue, que debe ser evaluado por su papel en la prevención de las infecciones virales en el mosquito. Este protocolo se ilustra cómo la extensión de infecciones de dengue de los mosquitos pueden ser analizados. Las técnicas para el cultivo de los virus en la cultura, la alimentación de los mosquitos membrana de sangre humana, y analizando los títulos virales en el intestino del mosquito se ha demostrado.

Resumen

El propósito de este procedimiento es para infectar a los mosquitos Aedes con el virus del dengue en una condición de laboratorio y examinar el nivel de infección y dinámica de los virus en los tejidos del mosquito. Este protocolo se utiliza rutinariamente para el estudio de las interacciones entre el virus de mosquitos, especialmente para la identificación de los factores del huésped novela que son capaces de determinar la competencia del vector. El experimento debe ser realizado en un laboratorio BSL2. Al igual que en las infecciones por Plasmodium falciparum, vestimenta adecuada, guantes y bata de laboratorio se debe usar en todo momento. Después del experimento, todos los materiales que entraron en contacto con el virus deben ser tratadas con etanol 75% y se blanquea antes de proceder con el lavado normal. Todos los otros materiales deben ser esterilizados en autoclave antes de desecharlos.

Protocolo

A. propagar el virus en la línea celular C6/36.

1. Las células crecen un 80% de confluencia en 75 cm ² frasco;
2. Retire el papel con 3.4 ml restantes en el frasco;
3. Tomar 0,5 ml de virus de archivo y añadir en la celda de arriba con la multiplicidad de infección de 1,5 partículas virales por célula. Agitando el matraz durante 15 minutos lentamente a la temperatura ambiente.
4. Incubar durante 45 minutos a 5% de CO ₂ y 37 ° C
5. Añadir 30 ml de medio, y se incuba durante 5 días.

B. Prepare la mezcla de virus y la sangre

1. Separe la celda con el raspador y la transferencia de la célula y los medios de comunicación a los 50 tubos cónicos mL;
2. Centrifugado a 800g durante 10 minutos, recoger el sobrenadante, pero deje 1 ml de sobrenadante con el pellet de células;
3. Congelar el sedimento celular por encima de las emisiones de CO ₂ en seco y luego descongelar a 37 ° C baño de agua, repetir dos o tres veces;
4. Centrifugado a 800g durante 10 minutos, tome el sobrenadante, y se combinan con el sobrenadante se recogió desde el paso 3;
5. Recoger la sangre humana entera con el mismo procedimiento (paso 3) para la preparación de la cultura de gametocitos de infectar a los mosquitos Anopheles con Plasmodium falciparum;
6. Combine la misma cantidad de lo anterior la sangre humana entera con sobrenadante de virus desde el paso 4, y añadir suero humano (10% del volumen total).
7. Incubar la mezcla por encima de la sangre humana y el virus del dengue durante 30 minutos a 37 ° C baño de agua

C. mosquitos Alimentación

Este procedimiento es casi idéntico a lo que se han descrito en la sección de infecciones por Plasmodium falciparum en los mosquitos. Nos ensayo de la infección del intestino medio en el día 7, y la infección por la saliva a los 14 días después de que se alimentan de sangre. Todo el material que entró en contacto con el virus se trata en primer lugar con el 75% de etanol y luego con lejía al 10%.

D. Ensayo el título del virus en los tejidos del mosquito

1. Dos o tres días antes de la disección de los tejidos del mosquito, crecer C6/36 células en una placa de 24, así como que las células alcanzan el 80% de confluencia en el día en que el ensayo se lleva a cabo;
2. Los mosquitos son anestesiados a 4 ° C, sacrificado y superficie estéril por inmersión en etanol al 75% durante 1 minuto. A continuación, los mosquitos se lavaron con agua estéril dos veces antes de la disección de las glándulas salivales del intestino medio o bajo el microscopio de disección. A partir de este paso, todo el procedimiento que figura a continuación se llevó a cabo en un ambiente estéril, como una cabina de seguridad biológica. Estos tejidos se transfiere a un tubo que contiene 150 l de medios y homogeneizado con una pastilla Kontes mortero motor durante 90 segundos;
3. Realizar una dilución al 1:100 añadiendo 10 l de la homogeneizado en 990 medios de comunicación l;
4. Hacer más de 1: 10, 1:100 y 1:1000 dilución con el medio de la placa de 96 pozos;
5. Retire el papel de la placa de 24 pocillos, y añadir 100 ml de cada una de las cuatro disoluciones correspondientes a cada pocillo;
6. Agitar la placa lentamente durante 15 minutos a la temperatura ambiente, luego se incuban durante 45 minutos a 5% de CO ₂ y 37 ° C;
7. Añadir 1 ml de Metilcelulosa superposición (1%) a cada pocillo;
8. Incubar las placas a 37 º C con CO2 al _5% durante 5 días;
9. Los pasos de aquí en adelante no requieren de un ambiente estéril, pero como con cualquier otro agente patógeno de cuidado se debe tomar en todo momento. Deseche superposición Metilcelulosa de cada placa y borrar para eliminar el exceso de material
10. Añadir 1 ml de solución fijadora metanol / acetona (1:1) a cada pocillo. Mantener a 4 ° C durante 1 hora;
11. Vierta el fijador, y lavar una vez con PBS 1X;
12. Hacer la dilución 1:1000 a la primaria de anticuerpos contra el virus con un 5% Blotto;
13. Añadir 200 l de fluido hiperinmune diluido a cada pocillo, incubar a 37 ° C durante 1 hora;
14. Extraer el líquido hiperinmune y la placa de lavar con PBS 1 X
15. Prepare una dilución 1:1000 de cabra anti-ratón conjugado (Cat. KPL # 074 a 1806) en BLOTTO del 5% (leche descremada en polvo 5 g en 100 ml de 1 X PBS), a continuación, añadir 200 l en cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 1 hora;
16. Prepare el sustrato de la siguiente manera: añadir 1 tableta de 3'-Diaminobencidina terrahydrochloride (Cat. Sigma # D5905) en 20 ml de 1 X PBS, después de disolverse, y se añaden 8 l de peroxidasa de hidrógeno al 30%
17. Añadir 200 l de sustrato por encima a cada pocillo. Deje reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos
18. Retire del sustrato y detener la reacción mediante la adición de 1 ml de agua destilada a cada pocillo
19. Vierta en platos de agua y secarlos a secas
20. Contar con la partícula del virus

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator				with 5% CO2, 37oC
50 ml conical tubes				plastic
human serum and blood				O+
pipette tip				for tissue culture
pipettman
Pasteur pipetts				glass, sterile
water bath				37C
centrifuge
parafilm
circulating water bath
glass membrane feeders				with rubber tubing to fit feeders
mosquito cups
75% ethanol
10% bleach
Tissue-culture plates				6-well, 24-well and 96-well plates
Petri dish				glass
Slides
fine-tip forceps
PBS				1X, sterile
dissecting microscope	Microscope
C6/36 cells	cells			For virus propagation
C6/36 medium				MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride		Sigma-Aldrich	D5905	1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase
30% hydrogen peroxidase
A. aegypti	Animal			mosquito