Perfiles de isótopos estables de flujo intermediarios metabólicos en fase de desarrollo y de Adultos Caenorhabditis elegans</em

Resumen

Perfiles de isótopos estables de análisis de cromatografía de gases espectrometría de masa de flujo de intermediario metabólico se describe en el nematodo, Caenorhabditis elegans. Los métodos son detallados para evaluar el enriquecimiento isotópico en el dióxido de carbono, ácidos orgánicos y aminoácidos después de la exposición, ya sea durante el desarrollo de isótopos en placas de agar o en la edad adulta en cultivo líquido.

Resumen

Perfiles de isótopos estables ha permitido a largo investigaciones sensibles de las consecuencias metabólicas de las mutaciones genéticas y / o tratamientos farmacológicos en modelos celulares y los mamíferos. A continuación, describimos los métodos detallados para realizar perfiles de isótopos estables del metabolismo intermediario y de flujo metabólico en el nematodo Caenorhabditis elegans. Se describen los métodos para crear perfiles de todo gusano aminoácidos libres, el dióxido de carbono marcado, etiquetado ácidos orgánicos y aminoácidos marcados en animales expuestos a cualquiera de los isótopos estables de desarrollo temprano en las placas de agar crecimiento de nematodos o los medios de comunicación a partir de adultos jóvenes por la exposición a diversos tratamientos farmacológicos en cultivo líquido. Los aminoácidos libres son cuantificados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en alícuotas gusano extrae todo en el 4% de ácido perclórico. Universalmente marcado ^{con 13} C-glucosa o 1,6 - ¹³ C _2-glucosa se ​​utiliza como precursor de isótopos estables de carbono marcado que se traza mediante espectrometría de masas de dióxido de carbono (tanto en la atmósfera y disuelto), así como en los metabolitos de indicativo de flujo a través de la glucólisis , el metabolismo del piruvato y el ciclo del ácido tricarboxílico. Los resultados representativos se incluyen para demostrar los efectos del tiempo de los isótopos de la exposición, varios protocolos de intercambio de bacterias, y otros métodos de interrupción del gusano de tipo salvaje nematodos, así como el grado relativo de incorporación de isótopos en el complejo III mitocondrial gusanos mutantes (ISP-1 (qm150) ) en relación con los gusanos de tipo salvaje. La aplicación de perfiles de isótopos estables en los nematodos de vida ofrece una capacidad nueva para investigar las alteraciones en el animal completo nivel metabólico en tiempo real que son causadas por desórdenes genéticos individuales y / o tratamientos farmacológicos.

Protocolo

Protocolo A: perfiles de isótopos estables del metabolismo intermediario en C. elegans desarrollo en las placas de NGM.

* Nota: el enriquecimiento del isótopo estable puede ser medido con éxito en las poblaciones de adultos jóvenes de nematodos después de la exposición de isótopos (ya sea con la glucosa universalmente marcado con C ¹³ o 1,6 - ¹³ C _2-glucosa) a partir ya sea en el desarrollo temprano o en la adultez temprana. Este protocolo facilita el seguimiento simultáneo de la salud animal, el desarrollo y el crecimiento en el estándar de nematodos crecimiento de los medios de comunicación (NGM) placas, que no es tan fácil de lograr en un cultivo líquido.

1. La preparación de 100 mm placas de Petri con 10 ml de medio de crecimiento de nematodos (NGM), por la técnica estándar de ^1.
2. Propagación NGM placas con OP50 E. coli ¹ y deje que se seque durante la noche.
3. Añadir 500 l de 200 mM 1,6 - ¹³ C ₂ la glucosa (para lograr una concentración final de 10 mM en la placa de NGM) de manera uniforme a la placa. Deje que se seque durante la noche.
4. Bleach grávidas gusanos adultos ^1. Placa de los huevos recuperados en las placas de NGM, sin bacterias o 1,6 - ¹³ C ₂ la glucosa. Se incuba a 20 ° C durante la noche.
5. Al día siguiente, la transferencia de nacidos, L1-arrestado larvas en placas de NGM previamente untado con 1,6 - ¹³ C _2-glucosa y E. OP50 coli (por el paso # 2, arriba). Criar gusanos de la etapa de adultos jóvenes (48 a 72 horas, dependiendo de la cepa), teniendo cuidado de los gusanos no mueren de hambre.
6. Recoger sincrónica, primer día de gusanos adultos jóvenes de las placas con 3.4 mL de S. basal.
7. Lavar los gusanos en 50 ml de S. basal en 50 ml tubos Falcon. Permita que los gusanos para que sedimenten por gravedad durante 5 minutos. Quitar el sobrenadante a ~ 5 ml. Repetir el lavado dos veces más.
8. Estimar el número de gusanos por cuenta tres alícuotas de 100 l ^2. Ajustar la concentración de gusano a 1000 gusanos / ml de S. basal.
9. Pipeta de 1 mL (1000 gusanos) en un tubo de centrífuga de 1.5 ml de plástico.
10. Añadir 69 l de 60% PCA contiene estándar interno (ε-aminocaproico) a una concentración final del 4% PCA y 200 mmol de patrón interno.
11. Vamos a resolver los gusanos por la gravedad x 5 minutos. Extraer y guardar el sobrenadante en otro tubo.
12. Moler las muestras del gusano de plástico con homogeneizador (Kontes Pellet Mortero) y motorizado de perforación (Kontes Pellet Motor maja inalámbrico) durante 15 segundos. Confirmar visualmente la interrupción del gusano por microscopía de luz. Repita si es necesario.
13. Transferir el sobrenadante del paso # 11 para combinar con homogeneizado desde el paso # 12.
14. Centrifugar la muestra a 2250 rpm (1.300 xg) durante 5 minutos.
15. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de vidrio de 7 ml. Guardar pastilla para el análisis de concentración de proteínas, como se detalla en el paso # 20, abajo.
16. muestras de pH de 8.7 (neutral) con rango de KOH 4N.
17. Centrifugar las muestras neutralizadas en 7 ml tubo de vidrio en 2250 rpm (1.300 xg) durante 5 minutos para eliminar las sales.
18. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de vidrio de 7 ml.
19. Preparación de muestras para la cuantificación de metabolitos neutralizado por:
    1. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Separe 50 L de muestra neutralizada por inyección directa en HPLC. Cuantificación de aminoácidos libres se realiza por HPLC (Varian) con derivatización pre-columna con detección de o-ftalaldehído y fluorescentes, como se describió previamente ^3-4.
    2. Cromatografía de gases / espectrometría de masas (GC / MS): Proceda con la extracción de las muestras restantes neutraliza con resina de intercambio iónico (Bio-Rad) para GC / MS determinación del enriquecimiento isotópico de aminoácidos y ácidos orgánicos, como se detalla en el Protocolo D.
20. Añadir 1 ml de NaOH 1N a la proteína restante pellet (desde el paso # 15) en 7 ml tubo de vidrio.
21. Incubar la muestra tratada con NaOH proteínas a temperatura ambiente durante la rotación (Labnet * Rotor LabRoller) durante la noche hasta que se disuelva.
22. Use 75-100 l de NaOH tratados con la proteína para determinar la concentración de proteínas por métodos estándar (ensayo de proteínas DC, Bio-rad).

Protocolo B. Estable perfil isotópico del metabolismo intermediario en el C. elegans jóvenes adultos en cultivo líquido.

* NOTA: Los efectos farmacológicos sobre el flujo de intermediarios metabólicos en los nematodos adultos pueden estudiar después de la exposición a partir isotópica en el primer día de la puesta de huevos, ya sea en placas NGM (véase el Protocolo A, arriba) o en cultivo líquido. Nosotros preferimos este último enfoque para maximizar la rentabilidad de los isótopos estables y la utilización terapéutica Agente.

1. Diluir sincrónica, primer día de puesta de huevos de los adultos jóvenes de S. basal contiene 0,0005% de colesterol (que se obtiene mediante la adición de 0,5 ml de 1% de colesterol (disuelto en etanol al 95%) a 1 litro de S. basal) a 2000 animales por cada 500 mL.
2. Establecer la cultura ~ 4 ml de volumen total (s) en 25 ml Erlenmeyer, de la siguiente manera:

   TRATAMIENTO:	NINGUNO	"A LAS DROGAS"
   S. basales de colesterol	3020 l	3020 uL - "Drogas" volumen
   De isótopos estables (1,6 - 13 C 2-glucosa)	80 l	80 l
   K12 E. coli (OD 660 2,5-3)	400 l	400 l
   Los gusanos adultos jóvenes (2.000)	500 l	500 l
   Un fármaco (concentración deseada)	-	Si lo desea

3. Cubra con papel de frascos. Agite frascos de 24 horas a 220 rpm en 20 ° C se incubaron plataforma de agitador.
4. Asegúrese de frascos no están completamente sellados, como el oxígeno es necesario para el flujo de intermediarios metabólicos y para la que resulta el etiquetado de los metabolitos endógenos nematodo.
5. Lavar los gusanos mediante la adición de 4 ml de volumen de cultivo a 46 ml de S. basal en un tubo de plástico de 50 ml cónicos. Permita que los gusanos para que sedimenten por gravedad durante 5 minutos. Vacío sobrenadante hasta ~ 5 ml de aspiración se mantiene. Repetir el lavado por rellenar el tubo dos veces más a 50 mL con S. basal.
6. Concentrado gusanos lavado a 1000 gusanos / mL en un tubo de centrífuga de 1,5 ml de plástico.
7. Añadir 69 l de 60% de ácido perclórico (PCA) y 2 l de 10 mM patrón interno (ε-aminocaproico) para lograr una concentración final de 200 mmol estándar interno y el 4% del PCA.
8. Preparar las muestras como los pasos por # 11-22 en el Protocolo A.

PROTOCOLO DE C-1. Supervisión del uso de isótopos en los gusanos adultos en las placas mediante el trazado de carbono marcado en dióxido de carbono atmosférico y se disuelven.

* NOTA: Mientras que los protocolos A y B detalle los métodos para controlar la incorporación de isótopos en metabolitos libres dentro de los gusanos más de 2-3 días de desarrollo o de un día de la vida adulta, respectivamente, la confirmación bruto del éxito y la cinética de incorporación de isótopos más de un curso corto período de tiempo (es decir, de minutos a horas) se puede lograr por la etiqueta de control del dióxido de carbono (CO ₂₎ que dejaron de gusanos o contenido en dióxido de carbono disuelto en extracto de gusano. Bacterias vivas o muertas pueden ser suministrados a las lombrices cuando se cultivan en placas (PROTOCOLO DE C-1). Las bacterias no es necesario para la exposición de isótopos de corta duración de los gusanos en un cultivo líquido (PROTOCOLO C-2).

1. La preparación de 100 mm placas de Petri con 10 ml de agar NGM. Propagación NGM placas con vivo o muerto UV-OP50 E. coli (como se muestra en la Figura 1). Permita que las placas que se seque durante la noche.
2. Añadir 500 l de 200 mM de ^{1,6-etiqueta-13} C-glucosa a _dos placas de difusión OP50 NGM (para la concentración de isótopos final de 10 mM en la placa de NGM). Permita que las placas que se seque durante la noche.
3. Obtener sincrónica, primer día de puesta de huevos, los gusanos adultos jóvenes cultivados en placas de agar NGM propagación sólo OP50 E. coli.
4. La transferencia de 1.000 gusanos adultos jóvenes experimental NGM placas de agar que contiene isótopos estables y E. coli (preparado como pasos por # 2.1, arriba).
5. Coloque la placa de NGM experimental (sin cubierta) en la cámara de vidrio personalizada equipadas con bien cerrados llave de 3 vías para permitir el muestreo de la atmósfera precisa y reemplazo. Cerrar inmediatamente las cámaras con disco de vidrio óptico transparente. Cubrir costura donde se encuentra el disco de vidrio en el plato con grasa de alto vacío para sellar. Registrar el tiempo como "0 Tiempo".
6. Muestra de 10 ml de la atmósfera de la cámara de vidrio de llave de 3 vías con una jeringa de 20 ml en los minutos 30, 60, 90 y 120. Transfiera cada muestra la atmósfera a un pre-preparadas 10 ml tapón de goma cubierta de tubo de vidrio que contiene 1 ml de una mM NaHCO ₃ en NaOH 0,1 N que ha sido sellado al vacío.
7. Inyectar 10 ml de vuelta de aire en cada cámara de vidrio a través de llave de 3 vías con una jeringa de 20 ml. Cerrar llave de paso a la cámara después del muestreo / reinyección de la atmósfera y antes de reanudar la incubación entre los puntos de tiempo de recogida.
8. Inyectar 100 l de ácido fosfórico 20% a través de tapón en 10 ml de tapón de goma cubierta de tubo de vidrio que contiene CO ₂ atmosférico muestra.
9. Quite los 2 ml de la atmósfera y lo inyecta en 12 ml de azul superior de un muestreador automático de tubos pre-llenado con helio para la medición del CO ₂ atmosférico.
10. Analizar "el CO ₂ atmosférico muestras" Espectrómetro de Masas por Gas-Ratio (Thermoquest Finnigan Delta Plus).
11. Cámaras abiertas de vidrio después de un periodo de dos horas de incubación, los isótopos y la recopilación de todas las muestras de la atmósfera.
12. Lavar los gusanos en platos NGM en 3 mL de S. basal.
13. Lavar los gusanos en 50 ml basal S. en 50 ml tubos Falcon. Repetir el lavado dos veces más.
14. Concentrar los gusanos de ~ 1000 gusanos / ml en 7 ml tubo de vidrio de fondo redondo (s).
15. Sellado al vacío con tubo de vidrio con tapón de goma.
16. Añadir 100 lde ácido fosfórico 20% a través de tapón de goma con una jeringa para liberar el CO ₂ disuelto.
17. Quite los 2 ml de la atmósfera y se inyecta en 12 ml de azul superior de un muestreador automático de tubos pre-llenado con helio para la medición de CO ₂ disuelto.
18. Analizar "el CO ₂ disuelto muestras" por espectrómetro de masas de gas-Ratio (Thermoquest Finnigan Delta Plus).

Alternativa Protocolo (C-2): la utilización de Vigilancia isotópicas en gusanos adultos en cultivo líquido mediante el trazado de carbono marcado en dióxido de carbono atmosférico y se disuelven.

1. Obtener sincrónica, primer día de la puesta de huevos, los gusanos adultos jóvenes cultivados en placas de agar NGM se extendió con OP50 E. coli.
2. Lavar los gusanos en 50 ml de S. basal en 50 ml tubos Falcon. Permita que los gusanos para que sedimenten por gravedad durante 5 minutos. Quitar el sobrenadante a ~ 5 ml. Repita el lavado dos veces más.
3. La transferencia de 1.000 gusanos adultos jóvenes en 1 ml basal S. de tubo de 10 ml de vidrio de fondo redondo. Añadir 10,1 l de 1 M de valores universalmente marcado con ¹³ C-glucosa a 1 ml de gusanos para alcanzar la concentración final de 10 mM.
4. Oxigenar el fondo redondo de tubo de vidrio que contiene los gusanos y los isótopos mediante el intercambio de la atmósfera con abundante oxígeno al 100% en el tubo abierto durante 2 minutos. Cierre inmediatamente el tubo con tapón de goma.
5. Agitar los tubos experimental en 20 ° C se incubaron agitador de plataforma a 220 rpm. Registro de la hora de inicio como "0 Tiempo".
6. Muestra de 5 ml de la atmósfera a partir de tubo de 10 ml de vidrio de fondo redondo con una jeringa de 10 ml y aguja de calibre 25 a través del tapón de goma en los minutos 30, 60, 90 y 120.
7. Transfiera cada muestra la atmósfera a un tapón de goma pre-preparados, superó el 10 ml tubo de vidrio que contiene 1 ml de 1 mM _de NaHCO3 en NaOH 0,1 N que ha sido sellado al vacío.
8. Inyectar 5 ml de aire nuevo en cada tubo de vidrio de fondo redondo experimental que contiene los gusanos y los isótopos a través de tapón de goma con una jeringa de 10 ml y aguja de calibre 25.
9. Reanudar de incubación de 10 tubos de vidrio experimental ml de fondo redondo que contiene los gusanos y los isótopos de agitación a 220 rpm entre los puntos de tiempo de recogida.
10. Inyectar 100 l de ácido fosfórico 20% a través de tapón en la atmósfera contiene tapón de goma cubierta 10 ml tubo de vidrio.
11. Quite los 2 ml de la atmósfera y se inyecta en 12 ml de azul superior de un muestreador automático de tubos pre-llenado con helio para la medición del CO ₂ atmosférico.
12. Analizar "el CO ₂ atmosférico muestras" Espectrómetro de Masas por Gas-Ratio (Thermoquest Finnigan Delta Plus).
13. Al final del período experimental, lavar los gusanos en 50 ml de S. basal en 50 ml tubo Falcon. Permita que el gusano de pellets para formar por gravedad. Vacío sobrenadante hasta ~ 5 ml de aspiración se mantiene. Repetir el lavado por dos veces más en 50 ml de S. basal.
14. Concentrar los gusanos de ~ 1000 gusanos / ml en 7 ml tubo de vidrio de fondo redondo. Añadir tapón de goma y el tubo sellado al vacío. Añadir 100 ml de ácido fosfórico del 20% utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 25 a través del tapón de goma para liberar CO ₂ disuelto gusano.
15. Quite los 2 ml y se inyecta la atmósfera en 12 ml de azul superior de un muestreador automático de tubos pre-llenado con helio para la medición de CO ₂ disuelto.
16. Analizar "el CO ₂ disuelto muestras" por espectrómetro de masas de gas-Ratio (Thermoquest Finnigan Delta Plus).

D. Protocolo de Procesamiento de neutralizar las muestras de los protocolos A y B para el análisis de aminoácidos y ácidos orgánicos por cromatografía de gases / espectrometría de masas.

1. Bolas de preparación:
   1. Añadir 1 N HCl para ambas AG 1 y Ag 50 cuentas por separado en vasos de 1 litro.
   2. Revuelva cada matraz durante 30 minutos con un agitador magnético.
   3. Lavar los granos con agua desionizada 10 veces hasta que el pH de los lavados son iguales a los del pH del agua.
2. Columna de preparación:
   1. Inserte un tapón de algodón justo por encima de la parte más estrecha de punta de la pipeta Pasteur.
   2. Añadir cuentas con cargo a cada uno de dos columnas por ejemplo, llenando cada uno de aproximadamente un tercio de la altura de la columna. Use gotas para la extracción de AG1 ácido orgánico. Use gotas para la extracción de AG50 de aminoácidos.
3. Procesamiento de la muestra:
   1. Añadir 500 ul de muestra a la columna con los granos AG1 cargos. Nada se añade a la muestra (véase el protocolo A, el paso # 19B) antes de aplicar a AG1 columna para extraer los ácidos orgánicos, si la muestra ya está a un pH neutro.
   2. Añadir 1 ml de HCl 0,1 N a la muestra restante antes de aplicarlo a la columna AG50 para extraer aminoácidos.
   3. Permita que las muestras se ejecuten de forma a través de columnas.
   4. Lavar la columna con agua 10 veces hasta que los lavados son neutros (pH 7.8).
   5. Eluir las columnas de frescos, con la etiqueta de cristal 4 viales ml de la muestra:
      1. Para la extracción de ácidos orgánicos, añadir 3 ml de HCl 3 N a AG1 columna. Esto permite el análisis de enriquecimiento de isótopos en el número total de átomos de carbono marcados entre las especies de 3 carbonos (lactato), 4 especies de carbono (aspartato, succinato, malato),5-carbono especies (glutamato), y 6 especies de carbono (citrato).
      2. Para la extracción de aminoácidos: añadir 3 ml de 4 N NH ₄ OH al AG50 columna. Esto permite el análisis de enriquecimiento de isótopos en el número total de átomos de carbono marcados entre tres especies de carbono (alanina) y 5-carbono especies (glutamina).
   6. Colocar los frascos en Reacti-Vap III del evaporador durante la noche hasta que se seque.

E. derivatización de muestras y en Ajustes del equipo de Espectrometría de Masas

Añadir 50 l de acetonitrilo y 50 L de n-metil-nt-butildimetilsililo trifluoroacetamida (MTBSTFA) a cada vial de la muestra. Cubierta, mezclar e incubar durante 30 minutos a 60 ° C. Inyectar 1.2 l por muestra en cromatografía de gases / espectrómetro de masas (GC / MS).

F. Análisis de los Resultados

1. La cuantificación de los picos de aminoácidos. La cuantificación de cada aminoácido mediante análisis de HPLC se calcula utilizando el área de cada pico en relación a la del estándar interno.
2. El cálculo de enriquecimiento isotópico. Enriquecimiento isotópico estable se calcula en Excel (Microsoft) para cada especie de acuerdo con la siguiente fórmula: Porcentaje de exceso de Atom, corregida (APE) = (R _{sa-R st)} * 100 / [(R _{sa-R st)} 100], donde R _SA - Relación de la muestra y R _st - Relación de la norma.
3. La evaluación de las diferencias estadísticas entre el enriquecimiento de la muestra. La t de Student prueba se utiliza para evaluar la importancia relativa de ácido amino y diferencias isotópicas entre las muestras de etiquetas.

Los resultados representativos:

Isótopos estables es bien incorporada en gusanos adultos jóvenes, como lo demuestra de carbono marcado en el CO ₂ atmosférico y el CO 2 disuelto gusano. En los gusanos alimentados ya sea vivo o muerto-UV irradiados OP50 E. coli, la proporción de ¹³ CO ₂ a ¹² CO ₂ fue mayor en las emisiones de CO ₂ disuelto gusano fracción en relación con el CO ₂ atmosférico liberado (Figura 1). Gusanos de alimentación viva o muerta OP50 E. coli no alteró significativamente la medida ¹³ CO ₂ a ¹² CO ₂ en relación extracto de gusano de lavado (véase el protocolo C1).

La exposición prolongada a los isótopos estables en el período larval mayor enriquecimiento isotópico en metabolitos intermediarios. El exceso de corregir por ciento de los átomos de carbono marcado en determinados metabolitos intermediarios de los jóvenes adultos de tipo salvaje gusanos fue mayor en todas las especies glutamato cuando los gusanos se alimentan universalmente marcado con ¹³ C-glucosa y bacterias viven en todo el desarrollo en relación con los animales tratados de forma similar alimenta las bacterias etiquetados para 48 sólo unas horas después de llegar a la puesta de huevos de la etapa adulta (Figura 2).

Efecto de la limpieza de veces en el enriquecimiento isotópico. Independientemente de timecourse la exposición, todos los animales criados en las placas se "borra" de marcaje isotópico antes de la preparación posterior de GC / MS. Comparación de protocolos de limpieza se realizó como se muestra en la Figura 2, incluyendo la alimentación de los gusanos durante 2 horas en placas de agar NGM se extendió con bacterias vivas fresco sin isótopos o la alimentación en placas de agar NGM sin bacterias durante 2 horas, y la alimentación en placas de agar NGM sin bacterias para 2 o 6 horas. Sin tener en cuenta, por supuesto, la exposición isotópica, no hubo diferencias significativas en el enriquecimiento isotópico en metabolitos intermediarios de los jóvenes adultos del gusano extraer todo se observó cuando los animales fueron absueltos en los platos, sin bacterias, ya sea para 2 o 6 horas. Por el contrario, el enriquecimiento isotópico menor se observó en los metabolitos intermediarios cuando los animales fueron posteriormente "limpiado" el exceso de isótopos se alimentan de las bacterias no etiquetados por dos horas. Sin embargo, el aumento de enriquecimiento en 3, 4 y 5 especies se hizo evidente cuando los gusanos fueron expuestos a los isótopos del período larval. Por lo tanto, el protocolo de limpieza óptimo se determinó que era claro gusanos después de su incubación en placas NGM se extendió con isótopos estables y las bacterias por la posterior incubación durante 2 horas en las placas de NGM unspread. Es de destacar que los gusanos crecen en cultivo líquido se lavaron clara de marcaje isotópico y bacterias en tres volúmenes de S. basal (ver Protocolo B); análisis GC / MS de lavado no mostró el enriquecimiento isotópico significativo por el tercer lavado.

Gusano de molienda produjo el enriquecimiento máximo en metabolitos intermediarios. Para optimizar el enriquecimiento por ciento en metabolitos intermedios siguientes condiciones de tratamiento similar, se hizo una comparación de las muestras del gusano interrumpido por ultrasonidos solo o ultrasonidos, además de molienda. La Figura 3 muestra que los gusanos interrumpió la exposición de isótopos siguientes por ultrasonidos, además de molienda había mayor enriquecimiento isotópico de muestras interrumpido sólo por ultrasonidos. Estos datos sugieren que las fracciones más sub-organismal fueron interrumpidos por la molienda de por ultrasonidos. Estudios posteriores revelaron la abrasión sola sin sonication fue suficiente para lograr el enriquecimiento isotópico máximo (datos no mostrados).

Exposición gusano isotópica permite el análisis conjunto del flujo de la vía intermediarios metabólicos. La alimentación de los gusanos que viven con el precursor de isótopos estables, ya sea durante el desarrollo (PROTOCOLO A, Figura 4) o los animales a partir de la etapa adulta (PROTOCOLO B, Figura 4B) permite el análisis de sensibilidad de enriquecimiento isotópico de los metabolitos indicativo de flujo a través de la glucólisis (lactato, alanina), el piruvato metabolismo (alanina), y el ciclo del ácido tricarboxílico (citrato, malato, succinato, aspartato, glutamato y glutamina). Universalmente marcado con ¹³ C-glucosa proporciona el etiquetado sólida de todas las especies de carbono, mientras que la utilización de 1,6 - ¹³ C _2-glucosa permite el etiquetado robusta sólo en una especie de cada metabolito. Esta técnica sensible puede distinguir las diferencias de tipo salvaje flujo gusano metabólica mitocondrial intermediario entre las cepas mutantes de la cadena respiratoria, como el complejo III mitocondrial subunidad mutante de la cadena respiratoria ISP-1 (qm150). La Figura 5 ilustra la magnitud de las diferencias observadas en la etiqueta de absoluta entre ISP-1 (qm150) y gusanos N2 cada expuestas durante 24 horas a 1,6 - ¹³ _C-2 de la glucosa en cultivo líquido con K12 E. bacterias coli desde el primer día de puesta de huevos etapa de adultos jóvenes (Protocolo B). Otros estudios de isótopos estables en un rango de mitocondrial gusanos mutantes están en marcha.

Figura 1. Universalmente marcado con ¹³ C-glucosa isótopos estables fue bien incorporados en gusanos adultos jóvenes de ¹³ CO _2: ^12. CO ₂ ratio (el exceso de átomos por ciento (APE), corregida) de tipo salvaje (N2) gusanos después de dos horas de alimentación universal- marcado ^{con 13} C-glucosa y ¹³ o bien la radiación UV-muertas o vivas OP50 bacterias en las placas (PROTOCOLO C1). incorporación C en metabolitos gusano fue sólido después de dos horas de exposición de isótopos. Barras azules y rojas indican el enriquecimiento isotópico relativa en fase gaseosa ("la atmósfera de CO _2") y la fase líquida ("gusano de CO _2"), respectivamente.

Figura 2. La exposición prolongada de isótopos a partir del período larval y, posteriormente, "limpiar" los gusanos en placas de agar NGM sin ​​un aumento de bacterias enriquecimiento isotópico en el glutamato libre de los gusanos adultos jóvenes. Enriquecimiento isotópico en las especies de glutamato se muestra para los gusanos alimentados con placas de agar NGM con universalmente marcado con- ¹³ C-glucosa y OP50 bacterias ya sea a través del desarrollo de la fase L1 larvas a través de la etapa adulta 959 células jóvenes ("L1", ver PROTOCOLO A), o cuarenta y ocho horas a partir de cuando los gusanos alcanzaron el primer día de puesta de huevos de los jóvenes adultos etapa ("YA"). Eje X indica el número total de átomos de carbono marcado en cada especie glutamato. Eje Y indica el enriquecimiento por ciento (corregido por el exceso de átomos (APE)). Las barras verdes indican gusanos borra la exposición de isótopos siguiente por la alimentación OP50 E. coli, sin placas de isótopos en NGM durante dos horas antes de la extracción del PCA. Barras de color azul y gris son los gusanos borra la exposición de isótopos siguiente rotulado NGM sin bacterias o de isótopos para dos o seis horas, respectivamente, antes de la extracción del PCA.

Figura 3. La interrupción de los gusanos de moler los rendimientos máximos de enriquecimiento isotópico en los metabolitos intermediarios del gusano. Por ciento de enriquecimiento de carbono se mide en una especie de citrato de tipo salvaje gusanos tratadas durante 24 horas en cultivo líquido con 1,6 - ¹³ C _2-glucosa sin bacterias (PROTOCOLO B). Barras de color negro y gris son los gusanos que se vieron afectadas por ultrasonidos sólo o por ultrasonidos y molienda, respectivamente. Enriquecimiento isotópico después de la exposición a 1,6 - ¹³ C _2-glucosa es el mejor evaluado en los metabolitos de la etiqueta de un átomo de carbono. Por el contrario, la etiqueta se enriquece en todas las especies de cada metabolito cuando universalmente ^marcado-13 C-glucosa es utilizada.

Figura 4. Los resultados representativos ilustran el grado de enriquecimiento isotópico en metabolitos intermediarios gusano indicativo de flujo a través de la glicólisis, el metabolismo del piruvato y el ciclo del ácido tricarboxílico. Corregido el exceso de átomos por ciento (APE) se determinó en los jóvenes adultos de tipo salvaje (N2 Bristol) gusanos después de 1, 6 a ¹³ C _2-glucosa exposición (A) durante el desarrollo de la etapa de L1 en los platos (PROTOCOLO A) o (B) a partir del primer día de puesta de huevos como los adultos jóvenes de 24 horas de cultivo líquido (PROTOCOLO B) . Las barras de error indican la desviación estándar, donde fiables los datos isotópicos de tres réplicas biológicas estaba disponible.

Figura 5. Cuantificación absoluta de aminoácidos de las especies de aminoácidos de metabolitos en las cepas de gusanos de tipo salvaje y mutante mitocondrial. Etiqueta absoluta en cada especie de cuatro aminoácidos se calculó multiplicando HPLC-determinó la concentración de aminoácidos libres (nmol / mg de proteína gusano) por un exceso de corrección por ciento de los átomos (APE) para cada especie. Barras de color gris y negro indican de tipo salvaje (N2 Bristol) y mitocondrial cepas mutantes complejo subunidad III (ISP-1 (qm150)), respectivamente. Las barras indican la media de tres experimentos biológicos replicar por cepa.

Discusión

La aplicación de la espectrometría de masas para medir la abundancia isotópica de metabolitos intermedios ofrece una imagen maravillosamente detallada de los cambios bioquímicos críticos ^5. En este caso, hemos proporcionado protocolos detallados para la explotación de esta metodología altamente sensible y específica para evaluar el flujo intermediario metabólico en el modelo animal genéticamente versátil, C. elegans. De hecho, la alimentación de los animales que viven con isótopos estables etiquetados precursores metabólicos (por ejemplo, ¹³ C-glucosa) permite la visión novedosa en el flujo vía intermediarios metabólicos en la medición de enriquecimiento isotópico en los metabolitos intermedios. Hemos desarrollado una metodología fiable para obtener un análisis sólido de flujo a través de la glicólisis, el metabolismo del piruvato y el ciclo del ácido tricarboxílico. Esto se puede lograr tanto en los animales alimentados con isótopos estables de las primeras etapas del desarrollo larval o principios en el período post-mitótico adultos. Enriquecimiento isotópico en diferentes especies de metabolitos pueden ser estudiadas en conjunto con el gusano entero sin perfil de aminoácidos por cromatografía líquida de alto rendimiento, como se describió anteriormente ^4, para determinar el enriquecimiento isotópico absoluta en las diferentes especies de gusano de alanina libre, aspartato, glutamato y la glutamina. De hecho, los patrones consistentes de enriquecimiento isotópico se obtienen al medir los aminoácidos y ácidos orgánicos analitos en alícuotas de entre 1.000 y 2.000 jóvenes gusanos adultos sincrónica. Dicha metodología sensible puede discriminar el flujo anormal de intermediario en el gen nuclear basada en las cepas mutantes mitocondrial en relación con los gusanos de tipo salvaje.

Esta técnica tiene un valor para investigar las alteraciones del flujo de vías bioquímicas específicas de interés común de los errores innatos del metabolismo. En particular, la utilización de la glucosa marcada con isótopos estables informa el flujo de carbono por el centro de las rutas metabólicas de interés para la enfermedad mitocondrial. De hecho, nuestros datos sugieren la aplicación de dicha metodología sensible puede discriminar flujo intermediario anormal en un gen nuclear basado mitocondrial subunidad compleja cepa mutante III (ISP-1 (qm150)) en relación con los gusanos de tipo salvaje.

Es importante reconocer que, desde la exposición isotópica se completa en un período de uno a varios días, el enriquecimiento isotópico cuantificados representa un "estado estable" valor de enriquecimiento y no cuantificables de flujo durante un período definido de tiempo que pudieran determinarse en la celda de los modelos basados ​​en expuestos a los isótopos de un periodo de minutos a horas. Otra limitación potencial de interrogar a la vía de flujo a lo largo del desarrollo de los nematodos se relaciona con diferentes longitudes de desarrollo de las larvas que se producen, en particular, cepas mutantes. Por ejemplo, muchas mutaciones mitocondriales severas son conocidos por causar un paro en la tercera (L3) estado larval ^6. Así, el análisis de la incorporación de isótopos sólo en los animales que sobreviven a la edad adulta puede no ser representativa de la población mutante todo. Sin embargo, esta metodología podría ser adaptado para evaluar la incorporación de isótopos en los metabolitos intermediarios en una etapa específica de larvas (por ejemplo, L2) en lugar de esperar a los animales para llegar a la etapa adulta. Del mismo modo, los animales que entran en la etapa larval alternativa conocida como Dauer probablemente han alterado significativamente (probabilidad baja) del metabolismo de flujo en relación con los animales que proceden directamente a través de los cuatro estadios larvarios. Estudio en el futuro también se podría realizar una evaluación directa de la incorporación isotópica en los animales etapa Dauer de diferentes orígenes genéticos. Exponiendo los animales a los isótopos estables por un período de tiempo fijo (en este caso, 24 a 48 horas) a partir una vez que los animales llegaron a la etapa de adulto joven (como se detalla en el Protocolo B) elimina el impacto de la variable de períodos de desarrollo. Mientras que el ¹³ C-glucosa en el metabolismo de la glucólisis sólo interroga, el piruvato y el flujo del ciclo del ácido tricarboxílico, otros trazadores isotópicos podrían ser evaluados para interrogar flujo vía bioquímica a través de otras vías de interés en los nematodos. Por ejemplo, ¹⁵ N-glicina podría ser utilizada para evaluar el volumen de negocios de aminoácidos en los nematodos.

Otra limitación potencial de este enfoque es el nivel de sensibilidad de la detección de metabolitos. Nuestra experiencia sugiere un mínimo de 500 nematodos adultos jóvenes son necesarios para cuantificar el éxito constitución isotópica de los métodos HPLC y GC / MS empleado aquí. Utilización de instrumentos con una mayor sensibilidad, como la cromatografía líquida de ultra (UPLC), puede permitir una mayor reducción del número de animales estudiados, aunque prevemos que esto es poco probable que permitan la cuantificación fiable de los metabolitos y la incorporación de isótopos en las especies de gusanos de un solo metabolito. Se estudiaron las poblaciones de gusanos de 1.000 animales por experimento, que nos pareció confiable detectar metabolitos de baja abundancia en cada cepa. Sin embargo, algunos metabolitos, como el GABA, sólo puede cuantificarse en las poblaciones mucho más grandes de los nematodos, en el orden de1x10 ⁶ animales ^4.

En resumen, los perfiles de isótopos estables proporciona una manera no invasiva y segura (no radiactivo) enfoque que ha sido utilizado para estudiar los errores innatos del metabolismo. Aplicación de esta metodología a C. elegans proporciona la capacidad de la novela para investigar in vivo, en tiempo real, las alteraciones metabólicas que se producen en el nivel animal entero, que puede ser consecuencia de trastornos genéticos individuales y / o exposiciones farmacológicas del agente.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. basal		1 - page 59	Protocols A and B
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8503	Protocol B
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protocols A and C
K12 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protocol B
NGM agar	Research Products International Corp.	N81800-1000.0	Protocols A, B, and C
13C glucose (universally labeled)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-1396	Protocol A and C
13C glucose (1,6 labeled)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-2717	Protocol B
60% Perchloric acid (PCA)	Fisher Scientific	MK2766500	Protocols A and B
ε-aminocaproic acid (Internal Standard)	Sigma-Aldrich	A-2504	Protocols A and B
MTBSTFA	Regis	270243	Protocol E
Acetonitrile	Regis	270010	Protocol E
AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin	Bio-Rad	140-1441	Protocols A and B (organic acid extraction)
AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin	Bio-Rad	142-1441	Protocols A and B (amino acid extraction)
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S-8875	Protocol C
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045	Protocol C
3N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol D
1N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol A
0.1 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol D
4N NH4OH	Sigma-Aldrich	30501	Protocol D
4N KOH	Sigma-Aldrich	484016	Protocols A and B
Deionized water	Milli Q Biocel	ZMQA60F01	Protocol D
Helium	Airgas	24001364	Protocol C2
SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope	Nikon Instruments	NI MNA41000	Protocols A, B, and C
pH meter	Fisher Scientific	S68167	Protocols A and B
Table top centrifuge - 5804R	Eppendorf	05-400-93	Protocols A and B
Incubated platform shaker	New Brunswick Scientific	M1324-0004	Protocol B
Mini LabRoller Rotator	Labnet International	H-5500	Protocols A and B
Pestles	Kontes Corp	K749520-0090	Protocols A and B
Drill	Kontes Corp	K749540-0000	Protocols A and B
1 L glass beaker	Fisher Scientific	02-539P
1 L Erlenmeyer Flasks	VWR international	89000-368
25 mL Erlenmeyer Flasks	VWR international	89000-356	Protocol B
7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper	VWR international	VT6431	Protocols A, B, and C1,C2
10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper	VWR international	VT6430	Protocol C2
Blue top tubes	Labco	438B
50 ml conical plastic tubes	Falcon BD	14-959-49A	All protocols
1.5 ml microfuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320	Protocols A and B
Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL)	BD Biosciences	301025, 301029, 301031	Protocols C1 and C2
25 gauge needles	Fisher Scientific	22-253-131	Protocols C1 and C2
Poly-Prep Chromatography Columns	Bio-Rad	731-1550	Protocol D
Pasteur pipettes	VWR international	14673-043	Protocol D
60mm Petri dishes	VWR international	25373-085	Protocol C
Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock	Custom Made		Protocol C
Optically transparent glass plate	Custom Made		Protocol C
Reacti-Vap III Evaporator	Thermo Fisher Scientific, Inc.	18826	Protocol D
Cotton	VWR international	14224-516	Protocol D
High Vacuum Grease	Dow Corning	1597418	Protocol C1
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-18	Protocol B
Timer	ISC Bioexpress	T-2504-5	Protocol C
Gas-Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Protocol D
GC-MS	Hewlett-Packard	5980/5971	Protocol D
GC-MS	Agilent Technologies	6980N/5973N	Protocol D
HPLC	Varian Inc., Agilent	9010	Protocol D