Microdisección de Negro Araña Viuda producción de las glándulas de seda

Resumen

A continuación se describe una estrategia eficaz para extirpar las glándulas productoras de seda desde el abdomen de la mujer araña viuda negro. Este procedimiento permite el rápido aislamiento de los productores de seda siete diferentes glándulas de una forma altamente purificada, un proceso importante para los investigadores que estudian la producción de la seda de araña y el montaje de la fibra.

Resumen

Arañas modernas giro fibras de alto rendimiento de seda con una amplia gama de funciones biológicas, incluyendo la captura de presas de locomoción, y la protección del desarrollo de ^1,2 hijos. Arañas realizar estas tareas al girar varios tipos de fibras distintas que tienen diferentes propiedades mecánicas. Esta especialización de los tipos de fibra se ha producido a través de la evolución de las diferentes glándulas productoras de seda, que funcionan como biofábricas pequeños. Estos fabricación biofábricas y almacenar grandes cantidades de proteínas de seda para la producción de fibra. A través de una serie compleja de eventos bioquímicos, estas proteínas de la seda se convierten de un líquido en un material sólido con la extrusión.

Estudios de mecánica han demostrado que las sedas de araña es más fuerte que acero de alta resistencia ^3. Los análisis para comprender la relación entre la estructura y función de hilos de seda de araña han revelado que la seda de araña consiste en gran parte de las proteínas, o fibroins, que se repite dentro de su bloque de secuencias de proteínas ^4. Común firmas moleculares que contribuyen a la resistencia a la tracción increíble y la extensibilidad de las sedas de araña se deshizo a través del análisis de ADNc de seda traducido. Teniendo en cuenta las propiedades del material extraordinario de araña sedas, los laboratorios de investigación en todo el mundo están compitiendo para comprender y simular el proceso de hilado para producir fibras sintéticas de seda para aplicaciones comerciales, industriales y militares. Uno de los principales desafíos a la hilatura de seda de araña artificial en el laboratorio de investigación consiste en un completo entendimiento de los procesos bioquímicos que ocurren durante la extrusión de las fibras de las glándulas productoras de seda.

Aquí presentamos un método para el aislamiento de los siete productores de seda diferentes glándulas de la araña viuda cobweaving negro, que incluye las glándulas ampullate mayores y menores [fabrica de seda draga y andamios] ^5,6, tubuliform [huevo sintetiza seda caso] ^{7 , 8,} flagelliform [función desconocida en la mazorca de los tejedores], agregado [hace cola de seda], aciniform [envolver la presa sintetiza las discusiones y huevo caso] ⁹ y piriforme [archivo adjunto produce seda disco] ^10. Este enfoque se basa en anestesiar a la araña con el gas de dióxido de carbono, la posterior separación del cefalotórax del abdomen, y microdisección del abdomen para obtener las glándulas productoras de seda. Tras la separación de los diferentes productores de seda glándulas, estos tejidos se pueden utilizar para recuperar las macromoléculas diferentes para los distintos análisis bioquímicos, incluyendo cuantitativos PCR en tiempo real, en el norte y el Western Blot, análisis de espectrometría de masas (MS o MS / MS) para identificar nuevas secuencias de proteínas de seda, la búsqueda de proteínas que participan en la ruta de la seda de montaje, o usar el tejido intacto para el cultivo celular o histológico experimentos.

Protocolo

1. Anestesiar a la araña y el aislamiento del abdomen

1. La transferencia de la araña de un frasco de vidrio en una caja de cartón forrada con plástico (Figura 1). Por lo general recogen las arañas de las pilas de madera, garajes o arbustos y la casa en el laboratorio en frascos de vidrio. Debido a que la araña no puede subir por las paredes de plástico, que proporciona un método eficiente para la transferencia de la araña de un frasco de vidrio o lata de café en un frasco más pequeño para fines de anestesia. Durante la manipulación de la araña en este punto, usted debe usar dos pares de guantes de látex o guantes de jardinería para la seguridad.
2. Mientras que la araña se encuentra en la caja forrada de plástico, el enfoque de la araña de su espalda y dejó caer la araña en el vial de la cultura de plástico. Después de la araña entra en el vial, inmediatamente coloque el enchufe en la parte superior (fig. 1B). Le recomendamos que utilice un vial que es de aproximadamente 101,6 mm x 31,75 mm (L x D). Esto minimiza la cantidad de dióxido de carbono necesarios para el paso de anestesia.
3. Anestesiar a la araña con la introducción de gas de dióxido de carbono a 10.5 libras por pulgada cuadrada de 10 min (fig. 1C). Esta cantidad de gas sólo se va a eliminar la araña a cabo por alrededor de 5 minutos, así que después de anestesia que de inmediato debe proceder a los pasos 1.4-1.5.
4. Coloque la araña anestesiados en un plato pequeña disección y el uso de fórceps para la posición de la araña a la cara dorsal (reloj de arena hacia abajo).
5. Clip del pedicelo (tallo delgado que conecta el cefalotórax y el abdomen) para liberar el abdomen del resto de la araña (Figura 1D). Guarde el cefalotórax en el congelador durante la noche en una placa de Petri y deseche después de congelado al día siguiente. Tenga cuidado al mover el cefalotórax como los colmillos de la araña están presentes en este segmento.
6. Fije el abdomen con el material Sylgard en el plato pequeña disección utilizando un alfiler insecto. Inserte el pasador de los insectos a través del agujero hecho en el recorte del pedúnculo (Figura 1). Esto puede ser fácilmente identificado como el sitio donde el líquido está saliendo de la saturación del pedúnculo. Asegúrese de que la hilera (extremo opuesto del pedúnculo) está orientado hacia la parte inferior (la más cercana a usted).

2. La eliminación del exoesqueleto

1. Hacer la primera incisión a través del exoesqueleto con un par de micro tijeras, empezando por el agujero de la saturación del pedúnculo. Corte lateralmente hasta la cara dorsal se alcanza en ambos lados (Figura 1 F). Con un par de pinzas, pele el segmento de exoesqueleto anterior e insertar un segundo pasador en este lugar. Después de la inserción de la espiga en segundo lugar, a su vez la bandeja de disección de caudal (90 °) a partir de los cortes laterales inicial y seguir cortando hasta que las hileras se alcanzan (Figura 1G). Esta incisión será perpendicular o vertical para el corte lateral inicial. No corte a través de las hileras, cuando la incisión vertical se hace (en relación posterior a la del reloj de arena y tiene un aspecto circular). La falta de insertar el pasador de segundo resultado en el abdomen de girar cuando las incisiones verticales se llevan a cabo.
2. Sumerja el abdomen en la disección de solución tampón (0,1 M de cloruro de sodio, citrato de sodio 0,015 M, un 0,1% dietil pirocarbonato).
3. Pelar el exoesqueleto restantes a partir de la incisión inicial, lateral. Cuando se termine esto, el tejido graso debe ser claramente visible (Figura 1H).

3. El aislamiento de las glándulas productoras de seda

1. Utilizando unas pinzas empiezan las burlas de distancia de la capa de grasa (Figura 1H). La grasa tiene un color blanquecino de aspecto amarillento. Continúe hasta que la mayor parte de la grasa se elimina y las glándulas de seda son claramente visibles. La glándula tubuliform consta de tres pares de mucho tiempo, tubos cilíndricos que son abundantes en la cavidad abdominal. El ampullate principales, que se encuentra en parejas, es una ampolla grande, forma de media luna con una larga cola de contorneado distal y proximal de un conducto que la disminución de anchura que se acerca a las hileras de la araña. El ampullate menores es muy similar en morfología a la ampullate importante, pero es significativamente menor. La glándula flagelliform, también se producen en pares, es redondo y multilobular de un tanque pequeño zig-zag del conducto que se extiende hacia abajo, hacia las hileras. La glándula agregada (que se encuentran en pares) es un muy grande, la glándula multinodular que tiene un conducto excretor muy grande que tiene grandes lóbulos, irregular en él. Las glándulas aciniform se producen en grandes cantidades y se asemejan a las proyecciones a corto, con forma de dedo pequeño. La glándula piriforme es la más pequeña glándula en el abdomen y tiene muchas vías compacta, cilíndrica que se asemejan a un ventilador con muchos pequeños conductos excretores que se extienden hasta las hileras.
2. Le recomendamos que quite las glándulas en el siguiente orden: tubuliform, ampullate importante, flagelliform, ampullate menor de edad, total, aciniform, y luego el piriforme (Figura 2A-B).
3. A partir de la tubuliform, se burlan de estas glándulas fuera del resto de thglándulas e - que debe estar sentado en la parte superior de las otras glándulas (Figura 2A). Hay tres pares de glándulas tubuliform en una sola araña. Les permiten flotar libremente, pero permanecer unidos a sus hileras de sus conductos.
4. A continuación, se burlan de distancia de las glándulas ampullate importante. Hay dos glándulas ampullate principales presentes en una araña. Durante el procedimiento de extracción, asegúrese de que los conductos de permanecer unidos a las glándulas (Figura 2A).
5. Seguir para molestar a los demás de las glándulas de distancia el uno del otro, trabajando con cuidado para evitar la perforación de cualquiera de las glándulas, sobre todo el conjunto y las glándulas flagelliform. Cada glándula debe ser de libre flotación todo el camino hasta su punto de salida en el exoesqueleto de las hileras. Estas glándulas se encuentran también en pares. Retire cada glándula apretando el conducto con una pinza y con mucho cuidado tirando hasta que se rompe con el punto de salida. El ampullate importante, flagelliform, ampullate menor de edad, y las glándulas agregado se encuentran en pares. Las glándulas aciniform piriforme y se producen en muchos pares más.
6. Retire cada glándula apretando el conducto con una pinza y con mucho cuidado tirando hasta que se rompe con el punto de salida por la hilera. Por lo general almacenar las glándulas húmedo, sin embargo, no añadimos tampón adicionales.
7. Como las glándulas se retiran, los coloca en el estéril pre-etiquetados de microcentrífuga de 1,5 ml. Glándulas individuales se muestran en la Figura 3-G. Mantenga estas glándulas en hielo y luego Flash congelarlos en nitrógeno líquido. Tras la congelación de flash en nitrógeno líquido, los colocan a -80 ° C para su almacenamiento.

4. Resultados representante

Al extraer las glándulas diferentes, el cuidado extremo se debe tomar en la manipulación del flagelliform y las glándulas agregado, ya que estas dos estructuras pueden ser fácilmente perforados y dañados con las pinzas. Por otra parte, cabe destacar que morfológicamente las glándulas flagelliform y agregados son muy similares antes de su retirada y que a menudo se entrelazan unos con otros. Para evitar la contaminación cruzada de estos tejidos después de la retirada, el disector cuidadosamente burlan de estas estructuras de separación. Además, en la exposición inicial de las glándulas productoras de seda, las glándulas aciniform y piriforme será el más difícil de visualizar de inmediato debido a su menor tamaño y localización anatómica. A menudo no es la presencia de muchos huevos. Por otra parte, la atención de las necesidades adicionales que deben adoptarse cuando la eliminación de la glándula piriforme, ya que este tejido es muy pegajosa y con frecuencia se adhiere a su fórceps. Cuando este procedimiento se realiza correctamente, es posible obtener las siete glándulas productoras de seda de la araña solo de una manera altamente purificada. Por lo general, se puede recuperar cantidades de microgramos de RNA total y proteínas a partir de una disección de la araña sola. Un ejemplo del uso del ARN total de qPCR para examinar los niveles de ARNm de un gen tubuliform restringido fibroína, TuSp1, se muestra (Figura 4). Representante experimentos que involucran proteínas lisados ​​recogidos de las glándulas, por ejemplo en la solución de digestión tríptica seguido por el análisis de MS (también podrían ser utilizados para análisis MS / MS) o un análisis de composición de aminoácidos se muestra (Figura 5.6, respectivamente).

Figura 1. Manipulación, anestesiar, y la eliminación del exoesqueleto del abdomen de una araña viuda negro femenino. A) La transferencia de la araña en una caja de cartón forrada con plástico para facilitar el movimiento de la araña en un frasco de plástico más pequeñas. B) Spider coloca en un frasco de plástico con tapón. C) La anestesia de la araña con el gas de dióxido de carbono. D) La separación del cefalotórax del abdomen utilizando micro tijeras. E) La inmovilización del abdomen en la bandeja de disección con alfileres de insectos. F) Vista después de una incisión lateral se hace con las tijeras y una parte del exoesqueleto se repicaron de nuevo con las pinzas. G) Las incisiones que se hizo el corte perpendicular al lateral inicial. H) La eliminación del exoesqueleto y la exposición de la capa de grasa.

Figura 2. Visualización de los siete diferentes glándulas productoras de seda, mientras permanezca intacto en el abdomen de la araña, así como los tejidos circundantes. A) Las imágenes de la tubuliform, ampullate importante, flagelliform, tejidos agregado, ampullate menores con un aumento de 12X. B) Imagen de la aciniform piriforme y glándulas con un aumento de 12X.

Figura 3. Fotografías de las siete glándulas productoras de seda después de su eliminación del abdomen. Todas las imágenes fueron captadas a 20X, con la excepción de la aciniform y las glándulas piriforme, que se realiza a 40X. Una de las principales)ampullate glándula; B) ampullate mayores y menores (lado derecho) para la comparación de tamaño; C) tubuliform; D) flagelliform; E) total; F) aciniform; G) piriforme.

Figura 4. Los resultados representativos del patrón de expresión del gen de la seda, TuSp1, después de examinar el TuSp1 niveles de mRNA en la producción de diferentes glándulas de seda (con exclusión de la glándula piriforme) utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) de aislamiento tras de ARN total de las glándulas.

Figura 5. Ejemplo de análisis de MS de extractos de proteínas obtenidos a partir de la glándula piriforme después de la digestión en solución tríptico. Nota: x2 representa 2 veces el aumento de la intensidad del espectro. Espectro de masas de iones de péptidos que corresponden a las regiones de la fibroína PySp1 se muestran con el símbolo #.

Figura 6. Resultado típico del perfil de composición de aminoácidos de las proteínas extraídas de la glándula tubuliform. Nota: ASX = Asp y Asn; GLX = Glu y Gln. Coloración azul refleja aminoácidos con grupos polares de la cadena lateral, mientras que la coloración roja representa los residuos de aminoácidos con grupos no polares de la cadena lateral.

Discusión

Nuestra metodología para la microdisección de las glándulas productoras de seda de la araña viuda negro ofrece un medio eficaz para obtener altamente purificada producir seda glándulas. Disecciones se puede completar en 1,5 a 3 horas, produciendo un conjunto completo de las siete distintas glándulas productoras de seda de cobweavers. La obtención de alta pureza glándula de seda muestras permite a los investigadores la posibilidad de realizar una amplia gama de estudios bioquímicos, incluyendo la identificación...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Electron Microscopy Sciences	SX0420-1	0.1 M in water
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	D-5758 - 5 ml	0.1% v/v
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804 - 1 kg	0.015 M in water
Dissecting microscope	Leica Microsystems	Leica MZ16
Digital microscope camera	Leica Microsystems	DFC320	Software - Leica Application Suite v2.8.1
Vannas scissors	World Precision Instruments, Inc.	500260
Stainless steel forceps	World Precision Instruments, Inc.	501764	Mini Dumont #M5S
Insect pins	Indigo Instruments	33414-2	Insect pins #2
Small or large dissection dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S or DD-90-S	52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm
Drosophila culture vials	Carolina Biological	FR-17-3076	Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm