Evaluación de los comportamientos de interacción social

Resumen

Aquí se describe un protocolo detallado para el examen de la sociabilidad en ratones mediante el uso de la sociabilidad Crawley y la preferencia para la prueba de la novedad social. Se describen las ventajas y posibles aplicaciones de este procedimiento, incluyendo los detalles críticos importantes para la correcta interpretación de los resultados.

Resumen

Las interacciones sociales son un componente fundamental y de adaptación de la biología de varias especies. El reconocimiento social es fundamental para la estructura y la estabilidad de las redes y relaciones que definen las sociedades. Para los animales, como ratones, el reconocimiento de sus congéneres puede ser importante para mantener la jerarquía social y para la elección de la pareja ^1.

Una variedad de trastornos neuropsiquiátricos se caracterizan por alteraciones en el comportamiento social y el reconocimiento social, incluyendo la depresión, los trastornos del espectro autista, trastornos bipolares, trastornos obsesivo-compulsivos y la esquizofrenia. Los estudios de los seres humanos, así como modelos animales (por ejemplo, Drosophila melanogaster, el Caenorhabditis elegans, Mus musculus, Rattus norvegicus) han identificado los genes implicados en la regulación del comportamiento social ^2. Para evaluar la sociabilidad en modelos animales, varias pruebas de conducta se han desarrollado (revisado en ^3). Investigación de los procesos realizados en modelos animales y pruebas apropiadas para la conducta social puede llevar al desarrollo de mejores tratamientos para la psicopatología social.

La prueba de paradigma de tres cámaras se conoce como la sociabilidad Crawley y la preferencia por la novedad del protocolo social ha sido empleado con éxito para estudiar la afiliación social y la memoria social en varias líneas de ratones mutantes y puras (por ejemplo, ^4-7). El principio fundamental de esta prueba se basa en la libre elección por un ratón sujetos a pasar un tiempo en cualquiera de los compartimientos tres casilla durante dos sesiones experimentales, incluyendo el contacto indirecto con uno o dos ratones con los que no es familiar. Para cuantificar las tendencias sociales de la experimental de ratón, las principales tareas son para medir a) el tiempo dedicado a la novela misma especie, y b) la preferencia por la novela frente a una misma especie conocida. Por lo tanto, el diseño experimental de esta prueba permite evaluar dos aspectos fundamentales, pero distinguible de la conducta social, tales como la afiliación social / motivación, así como la memoria social y la novedad. "Sociabilidad", en este caso se define como la propensión a pasar tiempo con otro ratón, en comparación con el tiempo a solas en una sala idéntica, pero vacío ^7. "La preferencia por la novedad social" se define como la propensión a pasar tiempo con un ratón previamente unencountered en lugar de con un ratón familiares ^7. Esta prueba proporciona resultados robustos, que luego debe ser cuidadosamente analizada, interpretada y con el apoyo / confirmarse mediante pruebas de sociabilidad alternativa. Además de las aplicaciones específicas, prueba de Crawley sociabilidad puede ser incluido como un componente importante de la pantalla general del comportamiento de los ratones mutantes.

Protocolo

1. Equipos y sala de preparación:

1. El aparato de la sociabilidad Crawley y preferencia por la prueba de novedad social está compuesto por una rectangular, de tres cámaras caja. Cada cámara es de 19 x 45 cm y los muros divisorios están hechas de plexiglás transparente, con una sección central abierta, que permite el libre acceso a cada cámara.
2. Utilizar dos de copa idénticos, alambre de contenedores con tapas removibles que lo suficientemente grande para un solo ratón. Estos se colocan verticalmente en el interior del aparato, uno en cada cámara lateral, y contendrá el ratón ingenuo / desconocido. Cada contenedor está formado por cables de metal para permitir el intercambio de aire entre el interior y el exterior del cilindro, pero lo suficientemente pequeño como para evitar las interacciones físico directo entre un animal en su interior con una en el exterior.
3. Las pruebas de comportamiento se debe realizar 09 a.m.-06:00 pm.
4. Iluminación general habitación es de 650 lux.
5. Emplean a 6,0 Observer (Noldus) programa (o una alternativa adecuada) para controlar y registrar la observación y el seguimiento de los parámetros mencionados en el apartado 4.3.
6. Después de cada ensayo, limpiar todas las cámaras con el 70% de etanol (entre los ratones) y luego con Clidox 01:05:01 (entre las jaulas) para evitar el sesgo de recordatorio olfatorio y para asegurar una buena desinfección, respectivamente.
7. La persona que hace la observación tiene que ser por lo menos 2 metros de distancia del aparato.

2. Animal de preparación:

1. Casa tres-cinco ratones por jaula en una habitación con un 12 horas de luz / oscuridad ciclo (luces a las 7:00 am) con acceso ad libitum al alimento y agua, de acuerdo con las normas y los requisitos de orientación del Comité local de Cuidado de Animales y protocolos.
2. La transferencia de todas las jaulas de ratones en la habitación del comportamiento 30 minutos antes de la primera prueba comienza.
3. Hay dos clases de ratón necesarios para este experimento, uno que actúa como un control, ingenua o "unfamiliarized" de los animales y que es el sujeto de la prueba. Para el control del ratón un ratón del mismo origen (por lo general C57BL6), edad (por lo general de 8-12 semanas de edad), sexo y peso, sin ningún contacto previo (no de camada) con el ratón tema. Dos ratones de control se requieren por experimento, una se utiliza para la sesión I y otro para la sesión II. Los ratones de control puede utilizar el mismo entre los ensayos.

3. Habituación (adaptación):

1. Aislar a los compartimentos de derecha e izquierda mediante el uso de los muros de plexiglás división.
2. Lugar vacío vasos de contención de alambre en el centro de la cámara de derecha e izquierda (uno por cada sitio).
3. Coloque el ratón sujeto en el centro de la cámara intermedia de adaptación.
4. Habituarse durante 5 minutos.

4. Aspecto de afiliación social de la prueba (sesión I):

1. Coloque uno de los ratones de control ("Stranger 1") dentro de un vaso de contención de alambre que se encuentra en una de las cámaras laterales. La colocación de un extraño en el lado derecho o izquierdo de la cámara está alterado sistemáticamente entre los ensayos.
2. Remover los muros entre los compartimentos, para permitir el acceso libre para el ratón con sujeción a explorar cada una de las tres cámaras.
3. Inmediatamente, comienza el seguimiento y registro de los siguientes parámetros:
   1. la duración y la
   2. Número de acciones (activos) los contactos entre el ratón y el tema de vivienda taza de contención o no la vivienda un extraño un ratón, por cada cámara individualmente. El contacto directo entre el ratón y el tema de la copa de contención, o estiramiento del cuerpo del ratón en un área sujeta 5.3 cm alrededor de la taza se cuenta como un contacto activo;
   3. la duración y la
   4. número de conductas de otros sujetos con el ratón en cada compartimiento, como el senderismo, la auto-preparación, falta de movimientos del cuerpo durante más de 5 segundos ("congelación"), así como un comportamiento inusual, como saltar, comportamiento repetitivo, etc;
   5. la duración y la
   6. número de entradas a cada compartimento. El ratón es considerado en la cámara cuando la cabeza y cuatro patas han entrado en la cámara.
4. La duración de la sesión que está a 10 minutos.

5. Sociales Novedad / preferencia de sesión de la prueba (Sesión II):

1. Lugar a un ratón segundo control ("Stranger 2") dentro de una taza de alambre de contención idénticos en la cámara el lado opuesto (que había estado vacío durante la Sesión I). Monitorear los mismos parámetros descritos en el apartado 4.3, diferenciando los comportamientos entre los sujetos del ratón en la presencia de un extraño en comparación con el extraño 2.
2. La duración de la sesión II es de 10 minutos.

6. Análisis estadístico:

1. Al utilizar el programa de Origen 6.0 (o una alternativa adecuada) analizan los siguientes parámetros, utilizando los datos registrados:
   1. el número total de contactos y
   2. duración total de los contactos entre los memorandos de entendimiento experimentale y vacío de contención frente a la taza o vaso extraño vivienda 1 (en la sesión I), o entre el ratón experimental y la taza de la vivienda 1 vs extraño Extraño 2 (en la sesión II);
   3. la duración media por contacto;
   4. número total y la duración de otras conductas (congelación, la auto-preparación, caminar)
   5. el tiempo total invertido por el tema del ratón en cada compartimento.
2. Analizar las diferencias significativas para cada uno de los parámetros antes mencionados, mediante la comparación de los grupos:
   1. "Vacíos" de la Copa de contención frente a "Stranger 1" para un tipo salvaje (WT) sujeto
   2. "Vacíos" de contención frente a la taza "Stranger 1" para el ratón experimental (por ejemplo, un golpe de gracia, el ratón transgénico o tratadas con el medicamento, etc.)
   3. "Extraño un" vs "Stranger 2" para un tema PESO
   4. "Extraño un" vs "Stranger 2" para el ratón experimental (octavos de final, transgénicos, o tratadas con el medicamento, etc.)
3. Presentar cada conjunto de datos de los parámetros antes mencionados, como la Sesión I: temas WT y experimental; Sesión II: WT y los sujetos de experimentación, como se muestra en la Figura 1 (A y B) y 2 (A y B), respectivamente.

También es recomendable tener en cuenta otros parámetros, que ayudan en la estandarización de esta prueba, tales como la experiencia previa en el reconocimiento de patrones específicos de comportamiento del ratón, como la inhalación, el aseo, roce, lucha, de montaje, que puede ser en gran parte dependiente en la observación subjetiva y personal . La persona que actúa como el grabador de los parámetros de comportamiento durante la prueba debe ser ciega a las condiciones de genotipo o de tratamiento, y esta información decodificada después.

7. Los resultados representativos:

Un ejemplo de los dos pasos de la prueba de la interacción social se muestra en las figuras 1 y 2. La primera sesión de la prueba permite la estimación de pertenencia social y la motivación del ratón tema. En esta parte de la prueba, el ratón extraño fue encerrado en una taza de alambre circular que permite ponerse en contacto la nariz, pero impidió que los enfrentamientos entre los ratones. Estas condiciones garantizan que los enfoques sociales son iniciadas por el sujeto y el ratón son sólo de investigación, sin contacto físico directo. El ratón tiene la opción de pasar más tiempo alrededor de la taza de contención que contiene el ratón extraño o para evitar cualquier contacto por móvil en el compartimento con la taza vacía. Otros parámetros, como el número de contactos individuales, se puede utilizar en más de duración pasó cerca del ratón extraño.

Por lo general, un animal silvestre a pasar mucho más tiempo en el compartimiento con un extraño en comparación con el compartimiento con el vaso vacío (fig. 1A), lo que indica la sociabilidad normal, la motivación social y la afiliación. En ratones knockout GSK-3α, por ejemplo, no hay diferencias significativas entre el tiempo pasado con la taza vacía en comparación con la copa que contiene un extraño (fig. 1B), lo que indica la sociabilidad alterada en estos modelos animales ^6.

La segunda sesión de la prueba está diseñada para calcular la novedad social y la memoria social. En esta parte, el ratón tiene un tema de libre elección entre los primeros, ya investigados, el ratón desconocido (Extraño 1), y un ratón de la novela familiar (Extraño 2). Por lo general, un animal PESO recuerda su contacto previo con un extraño, y, en esta sesión, tiende a pasar más tiempo con el ratón recién encontrado (Extraño 2), lo que indica la memoria intacta social y predilección por las experiencias nuevas (Figura 2A).

A diferencia de ratones de tipo salvaje, la GSK-3α animales mutantes no muestran preferencia por la cámara que contiene un ratón recién introducidos (Extraño 2) en una cámara que contiene un ratón ya familiar (Extraño 1) en la sesión II (Figura 2B). Comportamiento indiferente de los ratones KO en esta prueba es un indicador de la motivación social y la disminución de la novedad.

. Figura 1 Sesión I: la afiliación social y la sociabilidad. La duración media del tiempo (± SEM) en la cámara con el extranjero ("lado extraño") en comparación con la cámara opuesta ("el lado vacío"). A diferencia de los machos WT (A), KO (B) los animales no demuestran una preferencia por la proximidad social por el gasto mismo tiempo en ambas cámaras. *** P ≤ 0,0001 en el grupo de WT.

Figura 2 Sesión II:. Memoria social y la novedad. La duración media de tiempo (± SEM) en la cámara con el ratón desconocido desde la fase de sociabilidad ("Stranger 1") y en la cámara opuesta, con un nuevo ratón desconocido ("Stranger 2"). A diferencia de los machos WT (A), KO (B) los animales no demuestran una preferencia por la novedad social, el gasto mismo tiempo en ambas cámaras. *** P ≤ 0,0001 en el grupo de WT.

Discusión

Mus musculus es una especie social que se dedica a los altos niveles de interacciones sociales recíprocas, las conductas de anidamiento comunal, sexual y crianza de los hijos, el olor marcaje territorial y ^8-10 comportamientos agresivos. Varias pruebas se han desarrollado para estudiar el comportamiento social en los ratones (revisado en ^3). A continuación, presentamos una prueba ampliamente utilizada para evaluar la sociabilidad en los ratones. Sociabilidad Crawley y la preferencia para la prueba de novedad social fue desarrollado originalmente por Crawley et al ^{7, 11.} Hay varias ventajas para el paradigma de tres cámaras, que mejoran la fiabilidad de los datos para el examen de la sociabilidad, la afiliación social, la memoria social y preferencia, utilizando procedimientos similares. La especificidad de esta prueba principal es el diseño en el que un ratón, ya unencountered por el que hayan sido objeto, se coloca debajo de una taza de alambre y sin poder moverse libremente. Esto evita el contacto físico directo, eliminando la lucha y / o comportamiento agresivo, pero permite la interacción sensorial (olfato, vista, oído, gusto). En estas condiciones, el ratón experimental inicia y termina cualquier interacción, teniendo siempre una elección entre el ratón desconocido vs contenedor vacío (en la 1 ª sesión), o entre el ratón familiares (Extraño 1) vs el ratón novela (Extraño 2). Por ejemplo, en pruebas de una cámara de interacción social, el ratón sujeto se expone a un extraño en la misma cámara, y puesto que ambos ratones son capaces de moverse libremente a los mencionados activos contacto físico tiende a ser dominante y no puede ser eliminado. El aparato de tres cámaras es mucho más grande que un dispositivo de cámara típica de un solo, lo que permite que el ratón sujetos a permanecer en las proximidades o moverse lejos del ratón extraño. Por lo tanto, el nivel de estrés de la prueba de sociabilidad Crawley es baja y la mayoría se producen al colocar el ratón experimental en un ambiente nuevo, que permite la repetición de esta prueba con el tiempo, por ejemplo en las diferentes edades de la cohorte mismo ratón: adultos vs juvenil. Mediante la comparación de un grupo de jóvenes de los animales con la misma cohorte, pero más, es posible hacer un seguimiento y discriminar entre el deterioro en el reconocimiento social de memoria frente social y / o deterioro cognitivo, que puede ser observado en la Sesión 2, y estar relacionado con la edad fisiología dependientes.

Esta prueba es relativamente lento (~ 40 minutos por ratón), que es una desventaja. Sin embargo, los repertorios múltiples de parámetros específicos se puede controlar y recodificado (de forma manual y / o video), lo que permite un análisis sólido. Por ejemplo, algunos de los parámetros adicionales, tales como el congelamiento y / o comportamiento de auto-preparación, pueden indicar aumento de la ansiedad y la disminución de la motivación para el comportamiento social. Al utilizar el mismo protocolo, los ratones pueden ser analizados de nuevo al día siguiente con un extraño mismo un mouse para descartar un efecto de la ansiedad social. Parámetros adicionales (tales como ruidos cola, mordiendo la copa de alambre donde se encuentra extraño 1) puede ser útil para distinguir el comportamiento agresivo en comparación con inusual facilidad hacia el animal novela. Ansiedad observan pueden ser debidos a la adaptación inadecuada de los ratones a la sala experimental, la iluminación ambiente excesiva, la salud pobre ratón, o como resultado de la modificación genética y / o la neofobia (en algunos modelos KO). Por otra parte, la habituación deteriorada, pueden ser interpretados como un deterioro cognitivo, y puede afectar los resultados de la segunda sesión. Antes de someter a ratones a esta prueba, es importante que los animales en la salud general y cribado neurológico, incluyendo la temperatura corporal y el peso, el examen de abrigo, y la serie de los siguientes exámenes de reflejos: bigotes, enderezamiento, el oído de contracción, alcanzando y tintineo de claves ( se describe en el ^12-15). Otras pruebas de comportamiento puede ser útil en la discriminación de respuestas específicas. Un mayor número de contactos y / o un aumento en la duración total de contactos activos puede asociarse con el comportamiento hiperactivo de las manchas de ratón específico, que puede ser confirmado mediante una prueba de campo abierto (para medir la actividad locomotora). Disminución de la duración y / o el número de contactos puede estar asociado con depresión y / o la ansiedad-como el comportamiento, que pueden ser evaluados mediante el uso de FST, TST o EPM, cero laberinto, las pruebas de luz / oscuridad, respectivamente (se describe en el ^{6, 13 , 15).}

Una vez que las condiciones de aplicación de las correspondientes y observaron diferencias significativas, no es un requisito para llevar a cabo exámenes de seguimiento, con el fin de confirmar los resultados. El olfato juega un papel clave en el reconocimiento social de los roedores, ya sea inducido químicamente anosmia o la eliminación de los bloques de órgano vomeronasal reconocimiento individual ^{16, 17.} Los ratones tienden a oler un olor nuevo y rápidamente se habitúan a su novedad. La prueba de bulbo olfatorio se puede utilizar para este propósito (se describe en el ^{6, 7).}

También hay modificaciones y el uso alternativo de prueba de tres compartimentos cámara de sociabilidad, tales como la estimación de la conducta maternal, al examinar el tiempopasó por una mujer sujeta proximal a una taza que contenga sus cachorros (que refleja la motivación de la madre), así como la motivación sexual, mediante la evaluación de la respuesta de una prueba hombre / mujer a un lugar femenino / masculino en la taza de un extraño en la sesión de 1 ^{7, 11.}

Otras pruebas se pueden utilizar para estudiar la sociabilidad en los ratones mediante el uso de métodos alternativos / paradigmas, tales como la interacción social en la jaula de alojamiento y / o en un ambiente de novela (una cámara de pruebas de interacción social), intruso residente, prueba de partición, prueba de enfoque social , la interacción social recíproca, etc (que se describe en ^{3, 18).} Vocalizaciones en los rangos ultrasónicos y sónicos, señales visuales, gustativas y táctiles modalidades también pueden contribuir a la comunicación de la información y de vinculación social (revisado en ^19).

Deterioro de la sociabilidad y el comportamiento social desregulación ha sido implicado como una característica de muchos trastornos psiquiátricos. Por ejemplo, el trastorno del espectro del autismo y la esquizofrenia son tanto caracteriza por deficiencias marcadas en la cognición social y el comportamiento social ^20, y las interrupciones del resultado de las relaciones sociales en un mayor riesgo de depresión ^21. Por lo tanto, la prueba que se describe aquí se puede utilizar en modelos animales de las condiciones mencionadas anteriormente. Por otra parte, este test es aplicable para determinar los posibles efectos de los compuestos farmacológicos sobre la sociabilidad (revisado en ^{3, 22-24).}

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol 70% (commercial Alcohols)	MSH	19901
Clidox 1:5:1 Base Activator	Pharmacal	96130F 95130F	1 part Base to 5 parts water to 1 part Activator