Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en 96 placas de microtitulación Bueno

Resumen

En este protocolo se presenta un método para medir Caenorhabditis elegans Vida en 96 placas microtiter así.

Resumen

Esperanza de vida es un proceso biológico regulado por varias vías genéticas. Una de las estrategias para investigar la biología del envejecimiento es el estudio de los animales, que contienen mutaciones en los componentes de la edad de regulación vías. Si estas mutaciones perturbar la función de la vía la edad reglamentaria y por lo tanto, alteran la vida de todo el organismo, que proporcionan importantes conocimientos mecánicos ^1-3.

Otra estrategia para investigar la regulación de la vida es el uso de pequeñas moléculas para perturbar la edad regulación vías. Hasta la fecha, un número de moléculas se sabe que extender la vida útil de varios organismos modelo y se utilizan como herramientas para estudiar la biología del envejecimiento ^16.4. El número de moléculas identificadas hasta el momento es pequeña comparada con la genética "herramientas" que está disponible para estudiar la biología del envejecimiento.

Caenorhabditis elegans es uno de los modelos de principio que se utiliza para estudiar el envejecimiento debido a su excelente genética y de corta vida útil de tres semanas. Más recientemente, C. elegans se ha convertido en un organismo modelo para las pantallas de fenotipo de drogas basado en ^5,7,16-20 debido a su pequeño tamaño y su capacidad de crecer en placas de microtitulación.

Aquí presentamos un ensayo para medir la C.elegans vida en 96 placas microtiter así. El ensayo fue desarrollado y utilizado con éxito a la pantalla de las grandes bibliotecas de moléculas que se extienden C.elegans vida ^7. La fiabilidad del ensayo fue evaluado en varias pruebas: en primer lugar, mediante la medición del tiempo de vida de los animales de tipo salvaje crecido a diferentes temperaturas, en segundo lugar, mediante la medición del tiempo de vida de los mutantes alterados con esperanzas de vida, en tercer lugar, mediante la medición de los cambios en la esperanza de vida en respuesta a diferentes concentraciones de los antidepresivos mirtazepina. Mirtazepina ha sido demostrado prolongar la vida en C.elegans ^7. Los resultados de estas pruebas muestran que el ensayo es capaz de replicar los hallazgos previos de otros ensayos y cuantitativos. El formato de microtitulación también hace que este ensayo vida compatible con los sistemas automatizados de manejo de líquidos y permite la integración en plataformas automatizadas.

Protocolo

Resumen: El protocolo se divide en cuatro partes. Parte 1 se describe cómo preparar la alimentación de las bacterias. La Parte 2 describe cómo preparar la lombricultura. Parte 3 describe la forma de puntuación vida. Parte 4 se muestran algunos resultados representativos, y la Parte 5 se describe cómo preparar las soluciones necesarias. Experimentos de vida útil tomar varias semanas para completarse. Para cada paso de la semana del protocolo, el día y hora del día se incluye para facilitar la planificación. La etapa L4 (día 0) se utiliza como punto de referencia para todo el protocolo.

1. Preparación de bacterias Alimentación

En esta sección se describe la preparación de las bacterias de alimentación. Los objetivos específicos E. coli cepa utilizada para alimentar a C.elegans se llama OP50. Antes de este protocolo, para evitar la contaminación cruzada de la lombricultura con otras bacterias, la cepa OP50 se ha hecho carbenicilina / resistentes a la ampicilina ^21. Preparar el OP50 cuatro a cinco días de antelación. Todos los materiales que entran en contacto con OP50 debe ser estéril.

Día 7: jueves (semana 1): Inocular 5 ml de la tuberculosis con 100 mg / ml ampicilina y 0,1 mg / ml de anfotericina B con una sola colonia OP50 e incubar durante la noche a 37 ° C en un agitador de bacterias.

-6 Día: viernes (semana 1).

Mañana 08:30. Inocular temprano para dar tiempo suficiente para que la cultura para alcanzar la saturación

1. Diluir el cultivo de una noche de OP50 1:2000 en TB 300 ml contiene 50 mg / ml de ampicilina. Incubar el cultivo de bacterias en un agitador durante 8-12 horas a 37 º C hasta que se alcanza la saturación. No permita que la cultura crezca más de 14 horas.
2. Transferir el OP50 en un tubo estéril, centrifugación pre-ponderado. Se precipitan los OP50 por centrifugación durante 10 minutos a 3500 rpm (2.200 xg) en una centrífuga de mesa.
3. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet OP50 en agua estéril y volver a una pastilla por centrifugación. Repetir este lavado dos veces.
4. Tras el segundo lavado, retire con cuidado toda el agua restante. No se debe dejar el agua en el tubo. Pesar el tubo de centrifugación que contiene la pastilla y restar el peso del tubo de centrifugación vacío con el fin de determinar el peso de la pastilla.
5. Bien volver a suspender el pellet en S-completa a una concentración de 100 mg / mL. No se debe dejar grumos.
6. La concentración de 100 mg / mL OP50 debe corresponder a 2 x 10 ¹⁰ bacterias / ml. El uso de un espectrómetro de fotos para determinar el número de bacterias por ml, si la relación entre la densidad óptica y el número de bacterias por mL se conoce. Si es necesario, ajustar la concentración de la solución de alimentación OP50 a 2 x 10 ¹⁰ bacterias / ml.
7. Guarde el OP50solution a 4 ° C hasta que se utiliza para el cultivo del gusano.

2. Preparación de una cultura del gusano síncrona

En esta sección se describe la preparación de la lombricultura. Su objetivo es generar una población en edad sincrónica de los gusanos. Todos los materiales que entran en contacto con C.elegans después del tratamiento blanqueador en el paso 5, debe ser estéril. Las placas se mantienen a 20 º C a menos que se indique lo contrario.

-6 Día: viernes (semana 1), 4:00 pm: Traslado de los animales a un plato fresco

1. Tome un plato días 50-10 NGM de edad en la que la mayoría de la población del gusano consiste en larvas L1 de hambre.
2. Esterilizar una espátula de metal por poco más de calor que un mechero de Bunsen. Deje que se enfríe. Use la espátula de refrigeración para cortar trozos de agar de la placa que contiene los gusanos de hambre. La transferencia de varios de estos trozos en una nueva placa de 10 cm NGM sembrado con OP50. Incubar durante aprox. 65 horas a 20 ° C hasta que la mayoría de la población de gusanos adultos se compone de gravidez. El tiempo necesario para que los animales muertos de hambre L1 se conviertan en adultos grávidas pueden variar de cepa a cepa.

-3 Día: Lunes (2 semanas) 10:00 am: Establecer una población síncrono

3. Recoger los gusanos de la placa de 10 cm, lávelos de la placa con 50-10 ml de agua estéril. Transferir la solución gusano / agua en un tubo cónico de 15 ml.
4. Lavar los gusanos mediante la centrifugación de 2 minutos en una centrífuga de mesa a 1200 rpm (280 xg). Desechar el sobrenadante y agregar 10 ml de agua. Repetir.
5. Aspirar el sobrenadante y añadir 5 ml de lejía recién preparada / solución de NaOH (2,5 cloro de uso doméstico ml, 1 ml NaOH 10N, 6,5 mL H ₂ O). Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente hasta que los gusanos se abren. Asegúrese de vórtice suavemente cada minuto. Monitorear el progreso de la reacción bajo el microscopio de disección.
6. Tan pronto como todos los adultos se disuelven, añadir 5 ml de buffer M9 para neutralizar la reacción.
7. Lavar los huevos tres veces con 10 ml de buffer M9 mediante la centrifugación de 2 minutos a 2500 rpm (1100 xg).
8. Lavar los huevos una vez con 10 ml S-completa mediante la centrifugación de 2 minutos a 2500 rpm (1.100 xg).
9. Eliminar el sobrenadante, agregar 10 ml de S-completa y transferir la solución a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Añadir 30 ml de S-completa a un volumen final de 40 ml. Agite suavemente el tubo de la noche a temperatura ambiente en un nutator o dispositivo similar.

Día -2: Martes (semana 2), 12:00 pm: La semilla de los animales en las placas

10. Bajo el microscopio de disección, comprobar si los gusanos nacidos durante la noche. Determinar la concentración de los gusanos en la solución de S-completa, contando el número de gusanos en 10 gotas l usando un microscopio de disección. Contar con al menos 10 gotas de cada muestra.
11. Vuelva a suspender los gusanos a una concentración de 80 a 100 lombrices / mL en el S-completo. Añadir carbenicilina (stock 100 mg / mL) a una concentración final de 50 mcg / ml y anfotericina B (stock 250 mg / mL) a una concentración final de 0,1 mg / ml. Agitar en un nutator. Si la preparación de grandes cantidades de gusanos, use un frasco de 600 ml Nunclon con la tapa del filtro.
12. A las 2:30 pm agregar el OP50 preparados en la parte 1 a una concentración final de 6 mg / ml (= 1,2 x 10 ⁹ bacterias / mL). Devolver el OP50 a 4 ° C.
13. Transferencia de 120 l de la solución worm/OP50 en cada pocillo de una placa y 96. Use placas de 96 pocillos con fondo transparente. Asegúrese de mantener a los gusanos en la suspensión, mientras que la pipeta.
14. Sellar la placa con un sellador de cinta para evitar la contaminación y la evaporación. Agitar la placa en un agitador de microplacas durante 2 min y se incuba durante 2 días a 20 ° C hasta que los animales llegan a la etapa L4.

Día 0: jueves (2 semanas) antes del mediodía: Esterilizar los animales mediante la adición de fluorodesoxiuridina (FUDR)

15. Para esterilizar a los animales añadir 30 l de una solución madre 0,6 mM FUDR a cada pocillo. En este paso el volumen final en cada pocillo a 150 l, y reduce la concentración final de OP50 de 6 mg / ml a 5 mg / ml (1x10 ⁹ bacterias / mL). Sellar la placa con cinta de selladores y agitar durante 2-3 min en un agitador de microplacas. Si el OP50 se añadió a las 2:30 en el día -2, es importante que el FUDR se añade antes del mediodía. Volver placas a los 20 ° C incubadora

Día 1: viernes (semana 2): Agregar a la cultura de las drogas

16. A las 9:00 am la mayoría de los animales deberán ser grávidas y contienen varios huevos cada una. Añadir las drogas cuyo efecto sobre el ciclo de vida se va a probar en la concentración deseada. Si la disolución de la droga en las concentraciones de DMSO final de DMSO no debe ser superior a 0,6%, como las concentraciones de DMSO 0,6% más alto que acortan la vida útil C.elegans. Después de la adición de las drogas, sellar las placas con cinta selladora y agitar durante 2-3 min en un agitador de microplacas. Volver placas a los 20 ° C incubadora
17. Adición de las drogas en ocasiones puede matar a algunos animales por plato, especialmente si se utiliza un solvente que el agua. El uso de un microscopio invertido para comprobar si hay animales muertos. Generalmente, no debe ser inferior a 10 animales muertos por placa de 96 pocillos. Volver placas a los 20 ° C incubadora.

Día 4: Lunes (3 semanas): selladores de Cambio

18. Para permitir que el oxígeno fresco entre la cultura de quitar el sellador, espere un minuto y vuelva a sellar la placa. Agitar la placa durante 2-3 minutos en un agitador de microplacas. Repetir una vez a la semana.

Día 5: Martes (semana 3): Añadir nuevas OP50 para evitar el hambre

19. Añadir 5 l de los 100 mg / mL OP50 solución que se preparó en una parte a cada uno de los 96 pozos para evitar el hambre.

3. La puntuación de vida.

En esta sección se describe cómo la supervivencia de la población de lombrices sincronizado de la Parte 2 se controla hasta que los animales murieron. Para observar a los animales en el 96 y placas, el uso de un microscopio invertido con un objetivo de 2x o 2.5x. Registro de datos de supervivencia de tres veces a la semana, lunes, miércoles y viernes. Usar el movimiento para determinar si los animales están vivos o muertos. Una luz intensa, especialmente por la luz azul, induce a los animales a moverse. No retire los animales muertos de la prueba. De vez en cuando, los animales que no se movió y se determinó el número de muertos en la anterior podría pasar más adelante.

1. En el día 0, al inicio del experimento contar el número total de gusanos en cada pozo. Censor pozos que contienen más de 18 animales a partir del análisis de los animales en estos pozos no tienen suficiente OP50 y mostrará los efectos de la restricción dietética.
2. Con el fin de aumentar la probabilidad de que los animales se mueven, sacudir la placa de 96 pocillos en un agitador de microplacas durante 2 min. antes del conteo.
3. En cada fecha de registro de conteo de sesiones y número de animales quese mueven como animales vivos. Movimiento en el líquido es mucho más fácil que en medio sólido y puede ser inducida por luz intensa. El uso de un mayor aumento puede ayudar a detectar movimientos muy sutiles, como los de la punta de la faringe. Estos movimientos sutiles son a menudo el movimiento sólo se observa en los animales muy viejos.
4. Volver placas a los 20 ° C incubadora
5. Repita el paso 2-4 cada dos o tres días hasta que todos los animales están muertos.

4. Los resultados representativos.

En esta sección se muestra un ejemplo de cómo llevar un registro de los datos de esperanza de vida generada por este análisis y algunos resultados representativos.

La figura 1A muestra un ejemplo de cómo registrar los datos de esperanza de vida durante este ensayo. Una hoja de Excel se utiliza para realizar un seguimiento de la supervivencia de las poblaciones en cada pozo. Para cada pozo es de coordenadas en la placa, la tensión, las drogas, la concentración de la droga y el número total de animales vivos en el día 0 (X0) se registra en el inicio del experimento. Fecha de registro, así como el número de animales muertos que viven y tres veces por semana para seguir a la supervivencia de las distintas poblaciones en cada pozo. Para graficar los resultados, calcular la fracción de animales vivos por cada día y la trama como una función del tiempo en días. P-valores deben ser calculados usando paquetes estadísticos como STATA o software similar.

El medio de vida de C. elegans es dependiente de la temperatura. Figura 1B muestra que los cambios dependen de la temperatura en la longevidad se reproducen con precisión por la esperanza de vida basado en microtitulación ensayo ^22. Del mismo modo, el ensayo de placa de microtitulación reproduce los cambios en la vida de los mutantes informó que tienen esperanzas de vida diferentes a los animales salvajes de tipo N2 ^{23-24 25} (fig. 1C).

El ensayo también puede utilizarse para hacer declaraciones más cuantitativo. En la media de Fig1D vida se representa como una función de la concentración mirtazepina ^7. Cada punto representa la media de esperanza de vida de la población 7-12, cada uno vive de una manera diferente también. A pesar de que el número de animales por pozo es relativamente baja (5-15 animales) y la variación a pozo es relativamente pequeño, como puede verse en las barras de error.

Figura 1. La placa de microtitulación basado vida ensayo reproduce con precisión los cambios en la esperanza de vida en la literatura.
(A) los datos de la muestra recogida en una hoja de cálculo Excel. En cada fecha de la sesión de conteo, las coordenadas del bien y el número de animales vivos y los muertos se registró. Al comienzo del experimento, el número total de animales en cada pozo se determinó. (B) Curva de supervivencia de tipo salvaje (N2) animales criados a 20 ° C y 25 ° C. (C) Las curvas de supervivencia de las cepas con mutaciones que afectan a la vida. Las cuatro cepas se analizaron en paralelo a 20 ° C. (D) de la curva dosis-respuesta mirtazepina N2 animales tratados. La media de esperanza de vida se representa como una función de la concentración mirtazepina. Las barras de error indican el SEM de 8 pozos por condición.

5. Los materiales.

M9 buffer, 1000 ml

• 6 g Na ₂ HPO ₄
• 3 g KH ₂ PO ₄
• 5 g de NaCl
• 0,25 g de MgSO ₄ 7H ₂ O ∙
• Añadir agua destilada hasta 1000 ml
• Autoclave

Potassiumphosphate buffer de pH 6,0, 1000 ml

• 136 g KH ₂ PO ₄
• Añadir agua desionizada hasta 900 ml
• Ajustar el pH a 6,0 con KOH 5M
• Añadir agua destilada hasta 1000 ml
• Autoclave

Traza una solución de metal

• 1,86 g de Na ₂ EDTA
• 0,69 g FeSO ₄ 7H ₂ O ∙
• 0,20 g _MnCl2 ∙ 4H ₂ O
• 0,29 g _ZnSO4 ∙ 7H ₂ O
• 0,016 g _de CuSO4
• 1000 ml de agua desionizada
• Autoclave y almacenar en la oscuridad.

S-basal medio, 1.000 ml

• 5,9 g de NaCl
• 50 ml de fosfato de potasio 1 M, pH 6,0
• 1000 ml de agua desionizada
• Autoclave
• Deje enfriar la solución y luego agregar 1 ml de colesterol 5 mg / mL (disuelto en Et-OH).

1M citrato de potasio, 1.000 ml

• 268,8 g de citrato tripotásico
• 26.3 monohidrato de ácido cítrico
• Añadir 900 ml de agua desionizada
• Ajustar el pH a 6,0 con KOH 5M
• Añadir agua destilada hasta 1000 ml
• Autoclave

S-medio completo, 1.000 ml

• 977 ml S-basal
• 10 ml de potasio 1M citrato pH 6 (estéril)
• 10 ml de traza de metales solución (estéril)
• 3 ml _de CaCl2 1M (estéril)
• 3 ml de 1M _MgSO4 (estéril)

NGM agar

• 3,0 g de NaCl
• 2.5g Pepton(A partir de la caseína, digerido pancreático)
• Agar 17g
• Añadir agua desionizada hasta 975 ml y una barra de agitación
• Autoclave
• Después del autoclave se enfríe a 55 ° C y añadir los siguientes componentes:
  • 0,5 ml de 1 M _de CaCl2 (estéril)
  • 1 ml de colesterol 5 mg / ml en etanol
  • 1 ml de 1M _MgSO4 (estéril)
  • 25 ml de tampón Potassiumphosphate, pH 6,0 (estéril)

TB, 1000 ml

• 12 g de triptona Bacto
• 24 g de extracto de levadura
• 4 ml de glicerol
• Añadir 900 ml de agua desionizada
• Autoclave
• Después del autoclave se enfríe a 55 ° C y añadir los siguientes componentes:
  • Añadir 100 ml de 0,17 KH ₂ PO ₄ / 0.72MK ₂ HPO ₄

0,6 mM fluorodesoxiuridina (FUDR, Sigma cat # F0503), 1000 ml

• 100 mg FUDR
• Se disuelven en 670 mL estéril S-completa, hacer 10 o 45 ml alícuotas ml.
• Almacenar a -20 ° C.

100 mg / carbenicilina ml, 10 ml

• 1 g carbenicilina
• 10 ml de agua desionizada estéril
• Filtrado estéril y alícuota
• Almacenar a -20 ° C.
• Usar a una concentración final de 50 mg / ml

250ug / ml de anfotericina B, 4 ml

• 1 mg de anfotericina B
• 4 ml de Et-OH
• Almacenar a -20 ° C
• Usar a una concentración final de 0,1 mg / ml

Discusión

El protocolo presentado permite la medición de la C.elegans vida en 96 placas microtiter así. Como se muestra en los resultados de la sección representativa de forma fiable replica los resultados anteriores y proporciona información cuantitativa. El uso de este ensayo hemos logrado examinados más de 89.000 moléculas por su efecto sobre C.elegans vida.

A los efectos de las drogas de detección, medición de vida útil en un formato de 96 pocillos de microtitulación tiene varias ventajas sobre la prueba clásica de los medios sólidos. Se reduce el trabajo necesario para la preparación de medios, la cantidad de espacio de incubación, y la cantidad de fármaco necesaria. El formato de 96 pozos y la instalación de microscopía permiten la automatización del ensayo completo de pruebas de detección de alto rendimiento.

Durante el desarrollo de la prueba de varios valores para cada variable y combinaciones de los mismos fueron evaluados por sus efectos sobre C.elegans vida. Estas pruebas incluyen la concentración de diferentes OP50 que van desde 3 a 10 mg / ml (3, 4, 6, 8, 10 mg / ml), distinto número de gusanos por pozo de entre 7 y 45 (7, 10, 15, 22, 45 gusanos / y), los volúmenes de diferentes cultura que van desde 40 hasta 150 l por pocillo (40, 60, 80, 100, 120, 150 l), y los cambios en la composición del buffer. Si se alimenta con un OP50 carbenicilina resistente, ni carbenicilina, ni la anfotericina B en las concentraciones indicadas se han encontrado para afectar C.elegans vida. Agitación continua suave de las placas, como se recomienda a menudo en la cultura C.elegans líquido, se encontró prescindible para los pequeños volúmenes utilizados en este ensayo. Agitación suave sin embargo es necesario si microplacas con los pozos más grandes se van a utilizar. Los valores indicados en este protocolo han sido cuidadosamente seleccionados sobre la base de comparación estadística de las distintas condiciones de prueba.

La característica más sorprendente de este ensayo es, probablemente, el hecho de que C. elegans se puede mantener en placas de 96 pozos que están selladas con cinta adhesiva. De lado a lado comparaciones no reveló ninguna diferencia en la esperanza de vida de los animales cultivados en placas de sellado, en placas de sellado con un sellador de plástico, o en placas selladas con selladores que permitan el intercambio de aire. En las tres condiciones, los animales desarrollaron muy homogénea de L1 a adultos grávidas en 65 horas y mostró esperanzas de vida muy similares. Animales criados de forma paralela en NGM desarrollado un poco más rápido, pero esta diferencia fue independiente de la presencia o ausencia de un sellador.

El protocolo presentado se basa en bacterias vivas, pero puede ser adaptado para que las bacterias muertas. Sin embargo, en un ensayo de líquido una bacteria sobrevivir solo se pueden multiplicar rápidamente y volver a llenar la cultura. En nuestras manos, la única manera confiable para matar las bacterias en la medida en que puedan ser utilizados para el cultivo líquido es por el tratamiento prolongado de las bacterias con irradiación gamma.

Un punto importante a considerar en la planificación de un experimento de vida es el poder de detección. Depende del tamaño del efecto, el efecto de la droga de interés deben ser probados en múltiples pozos. En un ensayo típico de 4 tratados con el fármaco y cuatro pozos de control, que corresponde aproximadamente a 40-50 animales cada uno, debería ser suficiente para detectar un aumento del 30% en el período de vida en más del 95% de los experimentos. Aumenta del 14% sólo se detectan en el 60% de los casos y por lo tanto requieren más pozos replicar.

La riqueza de los datos de esperanza de vida generada por este ensayo puede ser utilizado para desarrollar experimentos o cepa específica de los modelos de Gompertz paramétrico ^1. Estos modelos Gompertz son útiles para determinar la potencia de detección y para estimar el número de falsos positivos y negativos a gran escala de pantallas. Hemos verificado las predicciones de estos modelos en experimentos ciegos y los utilizó para estimar el número de falsos negativos en las pantallas de gran tamaño (resultados no publicados).

En resumen, podemos anticipar que el ensayo presentado será de gran utilidad para identificar pequeñas moléculas que prolongar la vida de C. elegans y estudiar los mecanismos subyacentes.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Calbiochem	cat# 171375	Also called Fungizone
FUDR	Sigma-Aldrich	cat# F0503	FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water
Mianserin	Sigma-Aldrich	M2525-250MG	Use as positive control at 50μM final concentration
Cyproheptadine	Sigma-Aldrich	cat#C6022-MG	Alternative positive control at 10 μM final concentration
Sealing Tape	Nalge Nunc international	cat# 236370	Polyester, non-sterile
96 well plate	Falcon BD	cat# 351172	Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene
Nunclon flask	Nalge Nunc international	cat# 178883	used for large volumes