Una de microfluidos basada en hidrodinámica trampa para las partículas individuales

Resumen

En este artículo se presenta un método basado en microfluídica para el confinamiento de partículas basado en el flujo hidrodinámico. Demostramos atrapando partículas estables en un punto de estancamiento de líquido mediante un mecanismo de control de retroalimentación, lo que permite el confinamiento y la micromanipulación de partículas arbitrarias en un microdispositivo integrado.

Resumen

La capacidad de confinar y manipular las partículas individuales en una solución libre es una tecnología clave para la ciencia fundamental y aplicada. Métodos para la captura de partículas basado en técnicas ópticas, magnéticas, electrocinética y acústicos han conducido a importantes avances en la física y la biología que van desde el molecular a nivel celular. En este artículo, se introduce una nueva técnica basada en microfluidos para atrapar las partículas y la manipulación basada únicamente en el flujo de fluido hidrodinámico. Usando este método, se demuestra la captura de partículas de micro-y nano-escala en soluciones acuosas de las escalas de tiempo. La trampa de la hidrodinámica se compone de un dispositivo integrado de microfluidos con una geometría de canales cruzados ranura en la que dos corrientes opuestas convergen laminar, lo que genera un flujo planar extensional con un punto de estancamiento de líquidos (cero punto la velocidad). En este dispositivo, las partículas están confinadas en el centro de la trampa de control activo del campo de flujo para mantener la posición de la partícula en el punto de estancamiento de líquidos. De esta manera, las partículas se encuentran atrapados en una solución de forma gratuita mediante un algoritmo de control de retroalimentación a cabo con un código personalizado, construido LabVIEW. El algoritmo de control consiste en la adquisición de imágenes de una partícula en el dispositivo de microfluidos, seguido por el rastreo de partículas, la determinación de la posición de la partícula centroide, y el ajuste activo del flujo de fluidos mediante la regulación de la presión aplicada a una válvula neumática en el chip con un regulador de presión. De esta manera, el on-chip las funciones dinámicas de la válvula de medición para regular las tasas de flujo relativo en los canales de salida, lo que permite a escala fina de control de posición de estancamiento punto y la captura de partículas. La trampa de la hidrodinámica de microfluidos basada en exposiciones de varias ventajas como un método para la captura de las partículas. Atrapando hidrodinámico es posible para cualquier partícula arbitraria sin requisitos específicos de las propiedades físicas o químicas del objeto atrapado. Además, la captura hidrodinámico permite el confinamiento de un objeto "único" objetivo de suspensiones de partículas concentradas o lleno de gente, que es difícil de usar la fuerza alternativa basada en el terreno los métodos de captura. La trampa de la hidrodinámica es fácil de usar, fácil de implementar y puede ser añadido a los actuales dispositivos de microfluídica para facilitar la captura y análisis a largo plazo de las partículas. En general, la trampa de la hidrodinámica es una nueva plataforma para el confinamiento, la micromanipulación, y la observación de las partículas sin inmovilización de superficie y elimina la necesidad de campos ópticos, magnéticos y eléctricos potencialmente perturbativa de la captura sin solución de partículas pequeñas.

Protocolo

La trampa de la hidrodinámica se compone de un híbrido de dos capas (polidimetilsiloxano (PDMS) / vidrio) dispositivo de microfluidos para el confinamiento de las partículas. Los pasos 1-2 describe la fabricación de dispositivos de microfluídica, y el proceso de diseño 4.3 dispositivo de discutir y operación.

1. SU-8 de fabricación del molde (no se muestra en el video)

1. Limpiar dos obleas de silicio (3 "de diámetro) con acetona y alcohol isopropílico (IPA).
2. Obleas seco con N ₂ y colocarlos en una placa calefactora a 65 ° C durante 1 minuto para eliminar la humedad residual.
3. Girar la oblea capa # 1 con SU-8 2050 fotosensible (PR) durante 30 segundos a 4000 rpm para crear un molde ~ 40 micras de espesor de la capa de fluido. Girar la oblea capa 2 con PR durante 30 segundos a 1500 rpm para crear un molde de ~ 150 m de espesor de la capa de control.
4. Soft oblea hornear # 1 a 65 ° C durante 3 minutos y luego a 95 ° C durante 6 minutos. Soft oblea hornear # 2 a 65 ° C durante 5 minutos y luego a 95 ° C durante 20 min.
5. Exponer las obleas a los rayos UV con sus respectivas máscaras (oblea de # 1: puertos y canales de fluidos, la oblea N º 2: el puerto y la capa de control) y la intensidad de la exposición adecuada (~ 150 mJ / cm ^2, ~ 260 mJ / cm ^2, respectivamente).
6. Después de la oblea hornear # 1 a 65 ° C durante 1 minuto y luego a 95 ° C durante 6 minutos. Después de la oblea hornear # 2 a 65 ° C durante 5 minutos y luego a 95 ° C durante 10 min.
7. Desarrollar obleas con acetato de propilenglicol metil éter (PGMEA) hasta curar PR se retira. Enjuague con obleas de IPA y secar con N _2.

2. Fabricación de dispositivos de microfluídica

1. Silanizar la superficie de la SU-8 moldes mediante la colocación de las obleas en un desecador al vacío durante unos 10 minutos con un plato de vidrio que contiene unas pocas gotas de triclorosilano. Silanización superficie ayuda a pelar las réplicas (PDMS) de los moldes de SU-8.
2. Mezclar y desgasificar PDMS en la base de: Relaciones de entrecruzamiento de 15:1 y 5:1 para los fluidos y las capas de control, respectivamente.
3. Girar la capa de mezcla 15:01 PDMS en el molde de la capa de fluido (oblea de # 1) durante 30 segundos a 750 rpm y luego colocar la oblea en una placa de Petri. Coloque el molde de la capa de control en una placa de Petri y verter la mezcla 05:01 PDMS sobre el molde con un espesor de ~ 4 mm.
4. Hornear galletas / PDMS durante 30 minutos a 70 ° C para curar parcialmente las capas de PDMS.
5. Después de enfriar las galletas / PDMS a temperatura ambiente, reducir la réplica de PDMS, que forma la capa de control (oblea de # 2), de la placa de Petri con un bisturí y despegarlo del molde SU-8. Perforadora un puerto de acceso a los microcanales que actuará como válvula de membrana en un chip con una aguja de calibre 21.
6. Lugar la réplica de PDMS con la capa de control sobre la oblea N º 1 (que tiene el spin-revestido PDMS capa de fluido). Alinee con cuidado y sellar la capa de control de la capa de fluido mediante un microscopio estereoscópico. Asegúrese de eliminar todas las burbujas de aire entre las capas y hornee a 70 ° C durante la noche para curar por completo las dos capas. Esta etapa de cocción se traducirá en una losa monolítica PDMS con dos capas.
7. Después de enfriar a temperatura ambiente, cortar y pelar la réplica de PDMS que contienen tanto el control como las capas de fluidos de la SU-8 del molde usando un bisturí. Eliminar el exceso de PDMS y separar cada unidad de dispositivo con una cuchilla de afeitar. Perforadora puertos de acceso a los microcanales en la capa de fluido con una aguja de calibre 21.
8. Bonos del PDMS losa para un cubreobjetos para obtener un dispositivo completo. Primero, limpie un cubreobjetos (No: 1,5, 24 x 45 mm) con acetona y el IPA. A continuación, tratar tanto el cubreobjetos y las superficies de PDMS réplica con plasma de oxígeno por debajo de 500 mTorr durante 30 segundos, e inmediatamente poner las dos superficies en contacto para formar un sello irreversible.
9. Hornee los dispositivos durante la noche para aumentar la unión entre las capas de PDMS y cubreobjetos los.

Pasos 3-4 describen la aplicación de la trampa de hidrodinámica de utilizar el dispositivo de microfluidos descrito anteriormente.

3. Instalación de trampas Experimental hidrodinámico

1. Coloque el dispositivo de microfluidos en el escenario de un microscopio invertido y seguro que con los clips de la etapa.
2. Llenar dos jeringas herméticas por separado con las soluciones tampón y la muestra y colocarlos en una bomba de jeringa Harvard Apparatus (PHD 2000 Programable). El buffer y las soluciones de muestra se entregan con el dispositivo de microfluidos a través de una de 1 ml y una jeringa de 250 l, respectivamente. Típicamente, un 50 mM Tris / HCl solución tampón Tris (pH 8,0) que contenía 0,02% v / v Triton X-100 se utiliza como la solución tampón. La solución de la muestra consiste en una suspensión de partículas (por ejemplo, bolas de poliestireno fluorescente) en la solución tampón.
3. Establecer las conexiones de fluidos entre las jeringas (la entrega de la muestra y el tampón) y el dispositivo de microfluidos. Conectar las jeringas de 1 / 16 "de diámetro exterior (OD) x 0.020" de diámetro interior (ID) perfluoroalkoxy (PFA) de mangueras mediante adaptadores luer-lock. Conecte el otro extremo del tubo de PFA a los puertos de entrada del dispositivo de microfluidos con meta de calibre 24l tubo. Un T-válvula puede ser colocada entre la jeringa de la muestra y el puerto de la muestra en el dispositivo de microfluidos para controlar la entrega de la muestra.
4. Establecer las conexiones de fluidos en los canales de salida en el dispositivo de microfluidos. Conectar los dos canales de salida para tubo de PFA (1 / 16 "OD x 0.020" ID) mediante el uso de tubos de metal de calibre 24. El tubo de PFA de las salidas deben ser de igual longitud. Sumerja los tubos de salida en un tubo de centrífuga de 1,5 mL llena con una solución buffer, que sirve para mantener una caída de presión constante entre las jeringas y los canales de salida.
5. Llene la válvula en el chip con aceite portador fluorados con un 3 ml luer jeringa de plástico para evitar las fugas de aire en la capa de fluido durante la operación. El aire en la cámara de válvula es empujado a través de la membrana de PDMS en los microcanales en la capa de fluido y más tarde retirado del dispositivo con el flujo de fluido a través de los puertos de salida.
6. Conecte una presión de gas inerte (nitrógeno) de suministro para el puerto en la capa de control para la operación de la válvula en el chip. Para ello, se utiliza un tanque de nitrógeno (2200 psi) y un regulador electrónico de presión de suministro de 00 a 30 psi en la válvula en el chip en el dispositivo de microfluidos. El tanque de nitrógeno se conecta al regulador de presión con ¼ "OD x .170" tubería de identificación. El regulador de presión se conecta al dispositivo de microfluidos a través de 1 / 16 "OD x 0.020" tubo ID PFA con 24 tubos de metal de calibre en su término.
7. Enjuague las conexiones de fluidos y el dispositivo de microfluidos con 0,5 ml de solución tampón para asegurar que todas las burbujas de aire del sistema, incluyendo los canales de salida. Las tasas típicas de flujo utilizado para limpiar las burbujas rango entre 2000-5000 l / hr. Después de las burbujas de aire se lavan fuera de los canales de microfluidos, reducir el caudal de 50-100 l / h, que es una tasa de flujo volumétrico típica para la captura de las partículas.
8. En este punto, las conexiones se establecen de fluidos, la muestra y las soluciones tampón se entregan en el dispositivo de microfluidos con un caudal fijo (50-100 l / h), y el dispositivo está listo para la captura de hidrodinámica.

4. Procedimiento de captura hidrodinámico

1. Ejecutar el código de costumbre-construido LabVIEW, que automatiza la captura de partículas (véase la Nota sobre el uso de LabVIEW código de abajo).
2. Usando el microscopio xy traducción etapa, la posición de la región de captura (cross-slot) en el centro de la vista de la cámara. Traer a la región de captura en el foco de la lente del objetivo y ajustar la configuración de la cámara para optimizar las condiciones de imagen.
3. Elija una región rectangular de interés (ROI) dentro del campo de la cámara de vista de tal manera que el centro del retorno de la inversión será la posición del centro de la trampa.
4. Inicializar la presión offset aplicada a la válvula en el chip. En uno de los canales de salida, una constricción 100-200 m de ancho se introduce para proporcionar una presión de desplazamiento de la válvula en el chip. La constante de off-set permite que la válvula de presión en el chip para ajustar la posición de punto de estancamiento en las inmediaciones del centro de la canal de la Mancha ranura. Para la mayoría de los experimentos, la presión de compensación se ajusta entre 0-12 psi dependiendo de las dimensiones del canal (altura y anchura), el ancho de la constricción, y las especificaciones de la válvula en el chip (tamaño de la válvula, el espesor de la membrana, etc.)
5. Iniciar el controlador de retroalimentación y ajuste la ganancia proporcional a optimizar la respuesta de la trampa. El controlador de retroalimentación ajusta la presión aplicada a la válvula en el chip con el fin de mover la posición del punto de estancamiento, lo que minimiza el error o la distancia entre la posición de la partícula y el punto (centro de la trampa). Dependiendo de la velocidad del flujo y la posición de la válvula en el chip, hay un valor óptimo de la ganancia proporcional, lo que aumenta la estabilidad de la trampa y elimina las oscilaciones no deseadas de las partículas.
6. Una trampa de partículas. El código de LabVIEW automáticamente trampa de una de las partículas que entran en la región de captura. Una vez que una partícula deseado es atrapado, se puede cerrar el flujo de la muestra y aislar la partícula atrapada en la solución tampón, si así lo desea.
7. Monitor de la partícula atrapada y mantener la concentración de partículas en el plano de la imagen utilizando el enfoque manual o una configuración de microscopio enfoque automático. Puede ser necesario ajustar levemente la ganancia proporcional del controlador de retroalimentación con el fin de garantizar la estabilidad de la trampa en el transcurso de un evento de captura de larga escala de tiempo (de minutos a horas).

Código de LabVIEW: Nota sobre el uso para el controlador de Comentarios

Atrapando las partículas automatizado se logra utilizando un algoritmo de control de retroalimentación lineal implementado mediante un código personalizado de LabVIEW. El código de LabVIEW captura imágenes de una cámara CCD y transmite un potencial eléctrico (voltaje) de un regulador de presión, que modula activamente la posición (estado parcialmente abierto / cerrado) de una válvula neumática en el chip dinámico. A medida que cambia la posición de la válvula, la tasa de flujo hidrodinámico en la línea de salida de un is ajustada, con lo que el cambio de posición del punto de estancamiento y que permite atrapar hidrodinámica. Los pasos en el circuito de retroalimentación de forma secuencial e iterativa ejecutado en la tasa de captura de imágenes (10-60 Hz). El código de LabVIEW ejecuta los siguientes pasos durante cada ciclo de retroalimentación:

• . Capturar la imagen Una imagen es adquirida por un "objetivo" de partículas en la región de la captura de los dispositivos de microfluidos con microscopía de fluorescencia con una lente de objetivo de 10x (NA: 0,4) y una cámara CCD.
• Rastreo de partículas. Partículas posición centroide se determina, y el algoritmo de rastreo de partículas se inicia. Las partículas se localizan mediante el ajuste del perfil de intensidad de emisión de la partícula a una función de dispersión puntual (PSF), de la cual se determina la posición del centro de gravedad.
• El control de flujo de campo. La presión actualizada destinada a la dinámica de la válvula en el chip se calcula utilizando un algoritmo de control de retroalimentación con un controlador proporcional. De esta manera, la acción de la válvula es volver a la posición del punto de estancamiento, que ejerce una fuerza sobre la partícula hidrodinámico para dirigir las partículas hacia el centro de la trampa.

El código de LabVIEW registros de los siguientes datos para cada imagen capturada durante la captura de partículas: 1) el tiempo transcurrido, 2) centroide (x, y) la posición de la partícula atrapada, 3) la posición del centro de la trampa, 4) la distancia de la partícula de la presión trampa centro, 5) aplicada a la válvula en el chip. Además, el código también se graba una película de la partícula atrapada en formato AVI.

5. Resultados representante

Estamos atrapados perlas fluorescentes de poliestireno de varios tamaños (100, 540, 830 nm y 2,2 m de diámetro) con una trampa hidrodinámica. Figura 1 (a) muestra una imagen de una partícula atrapada en el cruce transversal de la ranura de un dispositivo de microfluidos. La trayectoria de una partícula atrapada se puede determinar directamente a partir de los datos de posición registrados por el centro de gravedad código de LabVIEW en un evento de captura o mediante el seguimiento y la localización de la partícula atrapada en el archivo de película. Figura 1 (b) muestra la trayectoria de una partícula atrapada (2,2 micras fluorescentes de poliestireno de cuentas) a lo largo de la dirección del canal de salida. El grano es inicialmente atrapado (cuadrados) durante 3 min y se libera de la trampa y se escapa a lo largo de uno de los canales de salida (los círculos). Trayectorias de las partículas a lo largo del eje del flujo de compresión (dirección del canal de entrada, los datos no mostrados) son similares a las trayectorias de las partículas a lo largo del eje del flujo extensional (dirección salida) como se muestra en la Figura 1 (b). Un histograma de desplazamiento de partículas desde el centro de captura para una atrapada de bolas (2,2 m de diámetro) a lo largo de las direcciones de salida del canal se muestra en la Figura 1 (c). Utilizando el algoritmo de control de retroalimentación se describe en este trabajo, las partículas atrapadas se limitan a un margen de ± 1 m del centro de la trampa a lo largo de la entrada y salida de las direcciones de canal.

Un esquema del dispositivo de microfluidos utilizados para la captura de hidrodinámica se muestra en la Figura 2. El dispositivo de microfluidos integrado consiste en una capa de fluido y una capa de control y se fabrica utilizando la litografía blanda estándar de múltiples capas como se describe en este artículo. La capa de fluido contiene los canales de amortiguación y de la muestra, así como la geometría de canales cruzados ranura para facilitar la captura de hidrodinámica. La capa de control consta de una válvula neumática situado sobre uno de los canales de salida en la capa de fluido, y el control de fluidos y capas están separadas por una delgada membrana elastomérica. Durante el funcionamiento del dispositivo, la válvula en la capa de control se presuriza con gas nitrógeno, que las fuerzas de la fina membrana en la capa de fluido, lo que induce una constricción en el canal de salida. La válvula neumática dinámica constriñe el canal de salida de cantidades variables, cambiando la presión aplicada a la capa de control, que ajusta las tasas de flujo relativo en los canales de salida y permite a escala fina de control del punto de estancamiento.

Figura 1: Captura de partículas. (A) Imagen de una sola cuenta confinado en la trampa de la hidrodinámica. Además de la perla en el centro de la trampa, varias cuentas interceptadas se muestran en la región de captura. (B) la trayectoria de una partícula atrapada a lo largo de los canales de salida (cuadrados). Cuando la partícula se libera de la trampa (flecha), que escapa a lo largo de uno de los canales de salida (los círculos). (C) histograma de los desplazamientos de una atrapada de cuentas (2,2 m de diámetro) del centro de la trampa a lo largo de los canales de salida.

Figura 2. Esquema del dispositivo de microfluidos para la captura de hidrodinámica La trampa de la hidrodinámica se construye utilizando un dispositivo de microfluidos de dos capas. La capa de fluido se compone de una entrada de la muestra, fnuestras entradas de buffer, y dos salidas de residuos. La capa de control consta de una válvula neumática de membrana situada en la parte superior de uno de los canales de salida en la capa de fluido. Una constricción en el canal de salida opuestos proporciona una presión de desplazamiento de la válvula neumática. Las dimensiones típicas de canales oscila entre 100-500 micras. En la región (A), es el flujo de entrada de la muestra se centró en dos entradas de búfer. En la región (B), oponiéndose a las corrientes de entrada convergen en el cruce transversal de la ranura donde se produce atrapamiento. La válvula neumática (C) se coloca en la parte superior de uno de los canales de salida. La posición del punto de estancamiento es modulada por la regulación de la presión de esta válvula.

Discusión

Los actuales métodos de microfluidos para la manipulación de partículas basado en el flujo hidrodinámico puede ser caracterizado como métodos de contacto basados ​​en o sin contacto. Póngase en contacto con los métodos basados ​​en el uso de flujo de fluidos para limitar físicamente e inmovilizar las partículas contra las paredes del canal microfabricated ^9, mientras que los no-contacto métodos se basan en el flujo de circulación o microeddies ^10. En este trabajo se presenta un m...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 gauge blunt needle	Zephyrtronics	ZT-5-021-1-L	For punching port holes in PDMS
3 ml plastic syringe	BD Biosciences	309585	For filling valve with oil
Si wafers	University Wafer		3” P(100) single side polished 380 μm test grade
Cover glass	VWR international	48404-428	24 x 40 mm #1.5
DAQ card	National Instruments	PCI 6229
Fluorescent beads	Spherotech, Inc.	FP-2056-2	2.2 μm Nile red
Fluorinert	3M	FC 40	Fluorinated carrier oil
Inverted Microscope	Olympus Corporation	IX-71
LabVIEW	National Instruments	Version 9.0f3 (32bit)
Stereo Microscope	Leica Microsystems	MZ6	For aligning PDMS control layer to fluidic layer.
Mechanical Convection Oven	VWR international	1300U	For baking devices to create monolithic PDMS slabs with two layers.
Microfluidic tubing and connectors	Upchurch Scientific		1/16 x .020 PFA tubing and super flangeless fittings
PDMS	GE Healthcare	RTV 615 A&B
Plasma Chamber	Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-001
Pressure Transducer	Proportion Air	DQPV1
Spin Coater	Specialty Coating Systems	G3P-8 Spin Coat
Photoresist	MicroChem Corp.	SU 8 2050
Syringe Pump	Harvard Apparatus	PHD 2000 Programmable
Terminal Block	National Instruments	BNC 2110	For analog output to pressure regulator and read out.
UV Collimated Light Source and Exposure System	OAI	Model 30 Enhanced Light Source