Cuentas de la separación y las células en varios canales de dispositivos de microfluidos Con dielectroforesis y de flujo laminar

Resumen

Dielectroforesis (DEP) es un método eficaz para manipular células. Placas de circuito impreso (PCB) puede proporcionar electrodos de bajo costo, reutilizables y eficaz para el contacto libre de la manipulación de células dentro de los dispositivos de microfluidos. Mediante la combinación de PDMS basado en canales de microfluidos con cubreobjetos sobre los PCB, se demuestra la manipulación de cuentas y la separación dentro de la célula y multicanal dispositivos de microfluídica.

Resumen

Dispositivos de microfluídica han avanzado los estudios de células al brindar un ambiente de fluidos dinámicos en la escala de la célula para el estudio, la manipulación, clasificación y recuento de las células. Sin embargo, la manipulación de las células dentro del dominio fluido sigue siendo un reto y requiere de protocolos complicados de fabricación de válvulas de la formación y los electrodos, o las demandas equipos especiales como pinzas ópticas. Aquí, se demuestra que los circuitos impresos convencionales (PCB) se puede utilizar para la manipulación sin contacto de las células mediante el empleo de dielectroforesis (DEP) para la manipulación de cuentas y de células en los campos de flujo laminar para bioactuation, y para la separación celular y cuenta en microfluidos multicanal dispositivos. En primer lugar, se presenta el protocolo para el montaje de los electrodos de DEP y dispositivos de microfluidos, y la preparación de las células para DEP. Entonces, podemos caracterizar la operación de DEP con perlas de poliestireno. Por último, mostramos los resultados representativos de la separación de cuentas y celular en un dispositivo de microfluidos multicanal. En resumen, el DEP es un método eficaz para la manipulación de partículas (granos o células) en dispositivos de microfluidos.

Protocolo

Un esquema general de la instalación del equipo se muestra en la Figura 1. El conjunto de PCB de la muestra se detalla en una sección transversal esquemática en la Figura 1B.

1. Preparación de electrodos PCB:

1. Diseño de PCB electrodos a la geometría deseada para generar un campo eléctrico no uniforme. Fichas personalizadas electrodo PCB pueden ser ordenados a través de instalaciones de fabricación comercial (fig. 1C).
2. Prepare prefabricados electrodos PCB por soldadura de calibre 16 alambre al final de cada electrodo de metal impreso (Figura 1D).
   1. Coloque el cable en el extremo del electrodo. Mantener el alambre en su lugar en el área de metal de la placa con el hierro candente de soldadura para calentar el alambre.
   2. Alimentar a una pequeña cantidad de estaño en el alambre caliente para llenar el alambre con soldadura.
   3. Después de que el cable está llena de soldadura, retire el soldador y sujeta el cable en su lugar, mientras que la soldadura se enfría.
3. Repita el proceso de soldadura para cada conexión eléctrica en el circuito impreso (Figura 1D).

2. Preparar canales de microfluidos:

1. Polidimetilsiloxano (PDMS) basado en los canales de microfluidos se preparan con el elastómero PDMS, Sylgard 184 de Dow Corning. Un molde maestro que define los canales generalmente se crean a través de procesos de microfabricación estándar con una oblea de silicio y SU-8 fotosensible.
2. Mezcla de compuesto de base para el agente de curado en una proporción de 10:1 durante 5 minutos.
3. Vierta el líquido de PDMS sobre el molde prefabricado SU-8 maestros y eliminar las burbujas de aire mediante la exposición de PDMS líquido al vacío durante unos minutos. Repita el proceso de vacío, si es necesario para eliminar por completo todas las burbujas.
4. Curar el PDMS a 70 ° C durante 2 horas.
5. Quitar la losa PDMS con canales de microfluidos de la oblea con una cuchilla de afeitar, cuidado de no romper la oblea.
6. Hacer agujeros para la introducción de líquidos y las células en el dispositivo de microfluidos. (Nota: jeringa de bombeo, gravedad o la tensión superficial basado en el flujo se pueden usar con DEP).
7. Inspeccionar el dispositivo de microfluidos para asegurarse que esté libre de polvo y escombros. Limpieza del PDMS se puede lograr fácilmente con la cinta 3M Scotch Magic.
8. Plasma de bonos de la PDMS microfluidos canales para una limpieza no.0 espesor (80 a 130 micras) cubreobjetos. Calentar el conjunto de cubreobjetos-microfluidos a 100 ° C por un mínimo de 15 min.

3. Preparar de muy baja conductividad medios de comunicación:

1. De baja conductividad, los medios de comunicación se prepara mezclando 8,5% de sacarosa + 0,3% de glucosa (w / v) en agua desionizada (DI) ^1.
   Nota:. Hemos demostrado previamente que las células pueden ser cultivadas durante varios días en los medios de comunicación convencionales de cultivo de células después de ser expuesto a la baja conductividad por periodos cortos (de aproximadamente 30 min) ¹¹

4. Montar canales de microfluidos sobre electrodos PCB:

1. Coloque una pequeña cantidad (aproximadamente 10 l) de aceite mineral en el PCB para asegurar un contacto estrecho entre el PCB y el cubreobjetos.
   Nota: Un paso opcional para la disminución de la visualización del electrodo consiste en recubrir la superficie de la PCB con una capa muy delgada de marcador negro permanente o pintura.
2. Coloque el montaje del canal de microfluidos cubreobjetos, en el PCB engrasada, con el contacto cubreobjetos formando con el aceite (cubreobjetos hacia abajo). Presione suavemente el cubreobjetos-montaje de microfluidos hacia abajo para asegurar un buen contacto y para minimizar las burbujas de aire que pueden ser nocivas para la célula y la visualización de cuentas. Un ejemplo del dispositivo completo se muestra en la Figura 1D.

5. Ordenar y concentrado de Cuentas y las células con DEP:

1. Llenan los canales de microfluidos con agua destilada o de los medios de comunicación de baja conductividad, el proceso de unión de plasma facilita la carga fácil de las soluciones acuosas en los canales de microfluidos con carácter temporal, haciendo que la superficie PDMS normalmente hidrofóbicas hidrofílicos.
2. Introducir las células y / o cuentas de poliestireno en el depósito del canal (fig. 1C). Aquí se utiliza el adenocarcinoma de colon humano (HT-29) las células.
3. Conecte la salida de un generador de funciones a la entrada de un amplificador de corriente, conectar la salida del amplificador a los cables de los electrodos. Cubrir todos los cables eléctricos y las superficies de la instalación con cinta aislante para proteger a los usuarios de la exposición potencial a los golpes. Un diagrama esquemático de la instalación del equipo se muestra en la Figura 1.
4. Ajuste el generador de funciones para producir una salida de onda sinusoidal de 1.0 a 1.5 MHz. La amplitud de la salida debe ser ajustado por el amplificador de potencia RF para producir una potencia de 80-100V a la PCB. El amplificador de potencia RF en este trabajo requiere una tensión de entrada alrededor de 220 a 330 mV. Para separar las células y los granos, la tasa de flujo laminar debe ser compatible con la fuerza de DEP para mover las células y los granos en el canal principal (ancho w = 100 m, la altura h = 27 m) en los canales de destino (ancho w = 100 m , la altura h = 27 mm).
   Atención: consultar con el fabricante de PCB para determinar el mvoltajes MÁXIMO operativo para evitar problemas como el sobrecalentamiento de PCB o de fusión. Revise las especificaciones del fabricante del equipo para el generador de funciones y los fabricantes de amplificadores de potencia para determinar los ajustes de operación seguras.
5. DEP iniciar a las células de tipo y los granos. Las células de una experiencia positiva-DEP, mientras que bolas de poliestireno experiencia negativa-DEP en un campo eléctrico no uniforme dentro de las frecuencias especificadas. Esto permite que el DEP-fuerza activa bioactuation y la separación de las células y otras partículas dentro de los dispositivos de microfluidos con PCB accesibles y reutilizables como electrodos.

6. Los resultados representativos:

Cuando DEP es eficaz en las células de accionamiento o partículas, una alineación sólida dentro de no uniforme campos eléctricos se observa para los baños de estática o bajas velocidades del fluido. En condiciones de velocidades del fluido más alto, el comportamiento de las células o partículas depende de la orientación relativa del flujo axial para el campo eléctrico y la velocidad del flujo. Además, el comportamiento de células y partículas que también dependen de la intensidad de campo eléctrico y el grado de falta de uniformidad en el campo eléctrico. Los comportamientos característicos de las células o partículas son "cadenas de perlas, de ciclismo, pararse o girar.

Condiciones que ponen en peligro o suprimir DEP incluyen la presencia de sales y otras moléculas en el líquido iónico, la fuerza débil campo eléctrico, las velocidades de flujo excesivo, cubreobjetos que son demasiado gruesas, o soluciones conductora entre el cubreobjetos y electrodos PCB (por ejemplo, un cubre grietas pueden inducir la mezcla de agua y el aceite mineral).

En este caso, cuando se utiliza no.0 cubreobjetos espesor (80 a 130 micras) y una distancia entre electrodos de (231 m), el gradiente de la plaza de la intensidad del campo eléctrico aplicado a la células HT-29 y los granos se estima que entre 2 ^{-8-6 -8} V ² / m ^{3 1.}

La fuerza de DEP se puede estimar mediante la medición de la velocidad de la partícula, manipulado por el DEP en el fluido estático (Figura 2A-B). Debido a la pequeña inercia de la partícula y el medio ambiente de alta viscosidad del canal de microfluidos, la fuerza de arrastre hidrodinámico será igual, pero en dirección opuesta, con la fuerza de DEP. La velocidad media en el cordón de baja conductividad media es de 34,5 m / s con una tensión DEP de 93 Vpp y banda de 1,5. La fuerza de arrastre hidrodinámico se puede calcular con la siguiente ecuación ^1.

F = _arrastrar 6πηRv

El promedio de la viscosidad η de los medios de baja conductividad a 20 ° C es de 1.27 mPa • s y el radio R de cuentas es de 7,5 micras. La fuerza de arrastre hidrodinámico para el poliestireno microesferas se estima en 6,19 pN. Para demostrar la capacidad para actuar dentro de los canales de microfluidos cuentas (Figura 2C-F), se inició el flujo de los medios de comunicación de baja conductividad, mediante el empleo de la tensión superficial mediada por flujo. La velocidad media de cuentas en el canal de entrada única fue 1540 m / seg, mientras que la velocidad media dentro de los canales individuales se redujo a 565 m / seg (Figura 2 C). Al iniciar el DEP, los granos se mantiene en el canal central en lugar de ser liberados en el canal lateral. Así, bajo estas condiciones, las fuerzas DEP fueron suficientes para superar la fuerza de arrastre del fluido en los dos canales laterales.

El mismo principio también se utilizó para desviar las cuentas de la cannel central para un canal de una sola cara, simplemente cambiando la orientación de los canales y el flujo de grano a la de los electrodos DEP (Figura 2E-F). Inclinando el electrodo de metal en el lado del canal de entrada única, cuando se inició DEP, las cuentas fueron guiados a la parte del canal que las cuentas se acercó al punto de bifurcación. Allí, las fuerzas DEP bastaban para sacar las cuentas en uno de los canales laterales, donde el flujo laminar continuo para impulsarse por el canal (Figura 2F).

Dado que las células y microesferas de poliestireno tienen claras diferencias en su capacidad de ser polarizado y se realiza en no uniforme campos eléctricos, se utiliza DEP para demostrar la capacidad de realizar la separación en el chip de las células y los granos, al mismo tiempo. Se utilizó la misma estructura de canal de microfluidos y los electrodos de PCB como se ha configurado en la figura 2E-F, pero introdujo una suspensión de células HT-29 y los granos en los medios de comunicación de baja conductividad en el canal de entrada única (Figura 3). Cuando se introduce DEP, y en estas condiciones, el HT-29 células se mantuvieron en los dos canales de salida a la izquierda, mientras que las cuentas se mantuvieron en el canal de salida individual, en la derecha. Aquí las células muestran un comportamiento característico 'perlas en cadena ", ya que se recogen en el canal de salida izquierdo. De vez en cuando una gota y la célula se adhieren juntas en las que se agrupan, a menudo en los canales de la celda de salida. A partir de este experimentoal de datos, se determina la tasa de clasificación para 713 partículas (las células y los granos) por minuto, o el equivalente a 14.260 células y los granos en 20 minutos. El número de células y los granos recuperados es relevante y útil para la biología molecular, imágenes, bioquímicos y aplicaciones de laboratorio en un chip.

Figura 1. PCB-DEP basado en las células y partículas en los canales de microfluidos. (A) La configuración de los equipos de DEP basado actuación comienza con un generador de funciones para definir la frecuencia y la amplitud de la señal eléctrica, y luego un amplificador de potencia para aumentar la potencia de la señal de la campo eléctrico generado en el PCB. (B) El dispositivo de microfluidos para el accionamiento de la muestra se compone de PDMS canales de microfluidos irreversiblemente unido a un no. 0 cubreobjetos espesor (80 a 130 micras) a través de plasma de oxígeno, de medios no conductores a bañarse a las células y / o cuentas. (C) Los electrodos de PCB se utiliza aquí constan de dos regiones en las que los electrodos son interdigitados para generar una fuerte falta de uniformidad del campo eléctrico. (D) El dispositivo completo: una PCB con un dispositivo de microfluidos trifurcada en un cubreobjetos solo recuadro muestra el dispositivo completo con cables de los electrodos. (CD) para la escala, las mediciones de PCB son de 8,4 cm (largo), 2,1 cm (w), con 5 mm de ancho electrodos.

Figura 2. Imágenes representativas de las células y los granos en los canales antes y durante la actuación DEP. (A) 15 m cuentas fluorescentes de poliestireno en una baja conductividad de la solución de medios dentro de un canal de microfluidos PDMS, sin flujo laminar (tiempo transcurrido, 1,23 seg). (B) Al inicio de DEP, las cuentas de migrar hacia los patrones de electrodos PCB (rayas negro) en lugar de entre los electrodos (tiempo transcurrido, 8,18 seg). (C) Cuentas de los mismos canales de bajo flujo laminar se dividen entre los tres canales separados (lapso de tiempo, 5,3 segundos), cuando se inicia el DEP (D), las cuentas se activan a fluir sólo en el canal central (tiempo transcurrido, 4.3 seg). (E) Al cambiar la orientación de los canales de los electrodos de PCB, los granos pueden ser diferencialmente dirigidas hacia los canales laterales (F) con DEP en lugar del canal central, como se muestra en (D). (EF) Tiempo transcurrido es 8,23 segundos y 5,16 segundos, respectivamente. Todas las barras de escala = 100 micras.

Figura 3. Imágenes representativas de las células y los granos en los canales antes y durante la actuación DEP. (AB) Antes de iniciar el DEP, una solución mixta de adenocarcinoma de colon humano (HT-29) las células y el flujo de granos de un canal a 3 canales de salida independientes. La flecha abierta identifica la dirección del flujo laminar y los canales se describen con líneas de puntos para la orientación y aclaración. (CD) por la inducción de DEP, los granos y las células son accionados de forma selectiva en los canales por separado como se identifica. Células HT-29 la salida del canal central e izquierdo, mientras que cuentas salida del canal derecho. Cadena de perlas característicos de los granos y las células se observa durante DEP actuación. (A, C) La interferencia diferencial imagen de contraste de las células y los granos en microcanales hace las cuentas fácilmente visibles. Glow imágenes en escala de intensidad (B, D) de las mismas imágenes DIC (A, C) mejorar la visualización de las células en los canales. Los electrodos de metal reflectante ((A, C) de banda de luz y (B, D) de color amarillo y verde) ofrecen un importante punto de referencia para la alineación de microcanales de los electrodos para la eficacia de DEP basado en actuación. Las barras de escala = 100 micras.

Discusión

La manipulación de células en dispositivos de microfluidos es deseable para la clasificación o la colocación selectiva de células individuales o de los estudios de población. ² flujo laminar se utiliza en combinación con las válvulas y bombas para manipular las células dentro de los dispositivos de microfluidos. Sin embargo, estos métodos sólo son desafiantes y requieren procesos de fabricación detalladas y habilidades ³ centrifugación puede simplificar las exigencias para la colocación de la célula, pero las imágenes simultáneas es un reto. Por otra parte, la arquitectura de canal para la centrifugación se debe considerar con cuidado en el diseño de las manipulaciones deseadas y teniendo en cuenta los efectos las fuerzas centrípetas. ⁴ pinzas láser se puede utilizar para la colocación de la celda, pero el método es caro y no es susceptible de clasificación de células de alto rendimiento. ^{5 Sin} embargo, el DEP se ha demostrado como un sistema eficaz de "pinzas eléctricas" para la colocación efectiva de células, la caracterización y la manipulación de ^6,7.

En concreto, el DEP se ha utilizado para la captura selectiva y clasificar las células en el chip de procesamiento de la vida y las células muertas, ^7.10 y para recoger las células en los sensores de resonancia para la medición de la masa celular. ¹¹ Hemos demostrado anteriormente que al aumentar la DEP fuerza en las bacterias o los granos por encima de la fuerza de arrastre de fluidos, la concentración en el chip y la captura de perlas de poliestireno y Listeria monocytogenes V7 puede llevarse a cabo. ¹² poblaciones mixtas de E. coli y L. monocytogenes bacterias también pueden ser dirigidas y libera a través de pulsos de DEP. Además, las partículas más grandes pueden ser capturados diferencialmente y se concentró en los electrodos basados ​​en el tamaño de las partículas grandes, mientras que las partículas más pequeñas no se captura, pero se eliminan con el flujo de fluidos. ¹³ Cuando las fuerzas del DEP no superar las fuerzas de fluidos arrastrando las partículas, cordón o de células no es capturado, sino que se desplazaban dentro de la corriente de fluidos. Como se muestra en la Figura 2C, cuentas puede ser enfocada en la región central de la corriente de fluido suficiente para mantener las cuentas en el canal central. Esto podría ser debido al efecto combinado de las influencias de partículas a partículas en el campo eléctrico, las velocidades de fluido superior a DEP fuerzas de arrastre, la combinación de estos, o algún efecto indefinido otros.

Más recientes avances en la DEP sin contacto permiten maximizar la captura de células y la manipulación con el campo mínimo requerido, protegiendo así a los tipos de células, en la mayor medida, durante la manipulación DEP. ^1,9 DEP contacto promesa ofrece a la comunidad de microfluidos para la clasificación, recolección y colocación células dentro de los dispositivos de microfluidos. Anticipamos que con el aumento de la demanda, y la aplicación de DEP para la manipulación en dispositivos de microfluidos, descubrimientos e innovaciones se ampliará el entendimiento y la influencia de las fuerzas DEP.

Los PCB pueden ser fabricados a través de procesos de alto volumen a un precio asequible, con un tiempo de fabricación de respuesta rápida, por lo que buenas plataformas para la comercialización. Además, los PCB son fáciles de usar y accesible para los científicos en una amplia gama de disciplinas para la manipulación de células en el chip y la clasificación.

Al diseñar la disposición de los electrodos de PCB, se debe considerar a la partícula deseado / celular trayectoria. Los factores clave a considerar incluyen el tamaño de partícula y el tipo (de cuentas y / o celular), el tipo de células, el tamaño de microcanales, la velocidad del flujo, distancia entre electrodos (que determina la intensidad del campo eléctrico), el espesor de cubreobjetos, y la conductividad del fluido. Estos factores influyen en la fuerza necesaria y disponible para manipular la partícula o célula, y en última instancia, la eficiencia de separación. El protocolo presentado aquí demuestra una configuración eficaz para iniciar DEP para las microesferas y la separación de células. Para posibles aplicaciones, los usuarios deben coincidir con la arquitectura del diseño del canal de microfluidos con las vías de flujo deseado para las células y los granos, así como los patrones de electrodos para optimizar la eficiencia de cada aplicación. Distancia entre electrodos y el espesor de cubreobjetos se puede utilizar de acuerdo a las directrices ya se ha informado en el diseño de la disposición del canal de microfluidos. ¹

La conductividad y la permitividad de la célula / partícula y el medio circundante debe ser lo suficientemente diferentes como para facilitar el DEP positivo o negativo, manteniendo las células intactas. La polaridad de DEP para una partícula esférica se puede determinar a partir de la parte real de un valor complejo de las siguientes Clausius-Mosotti factor en el ω la frecuencia de la tensión de DEP.

La ecuación 1

En esta ecuación ε es la permitividad, σ es la conductividad y permitividad ε * es complejo. Los subíndices p y mdenotan la partícula y los medios de comunicación, respectivamente. Cuando una célula tiene una constante dieléctrica mayor que los medios de comunicación, o la parte real del factor de Clausius-Mosotti es positiva, la partícula se vuelve más polarizado que el medio circundante. Debido a un campo eléctrico no uniforme, la polarización de la partícula se convierte en no-uniforme y esto crea un DEP positivo (+ DEP) la fuerza que atrae a la célula hacia la región con una mayor intensidad de campo eléctrico. Si una celda tiene una constante dieléctrica menor que el medio circundante, o la parte real del factor de Clausius-Mosotti se convierte en negativo, se someterá a DEP negativo (DEP), y la célula se ve obligado hacia la región de campo mínima. Si la célula y los medios de comunicación tienen aproximadamente el mismo complejo permitividad, ninguna fuerza puede generar para manipular la célula. Por esta razón, el agua pura es un medio de comunicación preferido para la manipulación de partículas DEP. Sin embargo, para evitar el estrés osmótico en la célula de agua pura, los medios de comunicación de baja conductividad fue formulado para mantener la conductividad sin cambios, pero para aumentar la osmolaridad para disminuir la presión osmótica en las células. Convencionales medios de cultivo celular o tampones fisiológicos, tales como DMEM o PBS, tiene una alta conductividad, que no es adecuado para la manipulación de DEP.

También han demostrado previamente que las células pueden ser capturados en los sensores con DEP con baja conductividad de los medios. Después de un breve período para la adhesión celular, los medios de comunicación de baja conductividad puede ser sustituido por los medios de cultivo de células necesarias para apoyar el crecimiento de células para los días ^11.

Desde nuestra experiencia, perlas fluorescentes son muy brillantes, con respecto a la fluorescencia de células vivas, por lo que puede ser un desafío para que coincida con la intensidad de cuentas a la intensidad de una célula viva y fluorescentes. Para mejorar la visualización de las células y los granos, se utilizó la microscopía DIC en un microscopio vertical para obtener imágenes de ambos. Para visualizar las células y los granos, se presentaron los datos a una intensidad de brillo-escala de la imagen, que conserva los datos en un amplio espectro de colores para facilitar la visualización. Por lo tanto, al diseñar el estudio de interés, los parámetros de imagen y los recursos deben ser considerados.

En resumen, hemos demostrado la capacidad de actuar de forma selectiva las células de los granos y en canales separados con DEP. Con la utilidad cada vez mayor de canales de microfluidos para la biología celular, bioquímica y aplicaciones de la bioingeniería, la DEP es una opción deseable para la recogida de células, la colocación y la clasificación. La fabricación de PCB electrodos es barato y conveniente, los electrodos son fáciles de usar, y los tiempos de fabricación rápida son ideales para la aplicación de la DEP.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 kit (PDMS)	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Dow Corning Sylgard
16 awg hook-up wire	Belden	8521	(Type MW) Mil-W-76C-PVC
Gold seal Cover Glass	Ted Pella, Inc.	260320	No. 0 thick, 24 x 60 mm
Miltex Biopsy Punch	VWR international	95039-104	Miltex, assorted sizes
Custom PCB electrodes	Bay Area Circuits	Custom parts
Mineral oil	Fisher Scientific	O121-1
Deionized water	House DI water supply	None	Use filtered DI water
D-Glucose Anhydrous Granular AR	Mallinckrodt Baker Inc.	4912-06
Sucrose, Crystal	Mallinckrodt Baker Inc.	8360-06
Fluorescent polymer microspheres	Bangs Laboratories	FS07F/9277	15μm Dragon green microspheres
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38D	Human colon adenocarcinoma
Typsin 0.05% EDTA	Invitrogen	25300054
Eclipse E600FN upright microscope	Nikon Instruments	Eclipse E600FN
Phantom V310 High-speed imaging camera	Phantom	V310
BX51 upright research microscope	Olympus Corporation	BX51
SpotFlex high resolution color camera	Diagnostic Instruments	FX1520
Function generator	Agilent Technologies	3325A
RF Power amplifier	EIN	2100L