El uso de un sistema de suspensión de peso para la oclusión de la arteria renal aislada

Resumen

Un modelo murino precisa para la lesión renal aguda (IRA), debido a la isquemia es una herramienta importante para investigar la lesión renal aguda y, posiblemente, encontrar herramientas terapéuticas para tratar la lesión renal. El sistema de peso que cuelga ofrece una herramienta para la oclusión de la arteria renal inmediata y confiable y la reperfusión, sin causar congestión renal.

Resumen

En pacientes hospitalizados, más del 50% de los casos de insuficiencia renal aguda (IRA) son causados ​​por la isquemia renal ^1-3. Un estudio reciente de los pacientes hospitalizados reveló que sólo un leve aumento en los niveles de creatinina sérica (0,3 a 0,4 mg / dl) se asocia con un riesgo 70% mayor de muerte que en personas sin ningún tipo de incremento de ^1. En este sentido, los procedimientos quirúrgicos que requieren el pinzamiento de la aorta y los vasos renales se asocian con una tasa de fallos renales de hasta un 30% ^4. Del mismo modo, la IRA después de la cirugía cardíaca se produce en más del 10% de los pacientes en circunstancias normales y se asocia con un aumento espectacular de la mortalidad. AKI también son complicaciones frecuentes tras el trasplante hepático. Por lo menos 17.8% de los pacientes terminan requiriendo terapia de reemplazo renal ^5. Además, la función retardada del injerto debido a una lesión tubular de células durante el trasplante renal es con frecuencia relacionada con la isquemia asociada con lesión renal aguda ^6. Por otra parte, la IRA se produce en aproximadamente el 20% de los pacientes con sepsis ^6. La aparición de la lesión renal aguda se asocia con un aumento espectacular de la morbilidad y la mortalidad ^1. Enfoques terapéuticos son muy limitados y la mayoría de los ensayos de intervención en AKI han fracasado en los seres humanos. Por lo tanto, las modalidades terapéuticas adicionales para prevenir el daño renal por isquemia se necesitan con urgencia ^{3, 7-9.}

Para dilucidar los mecanismos de lesión renal por isquemia y posibles estrategias de los modelos murinos terapéuticos son intensamente requeridas ^13.07. Modelos de ratón proporcionan la posibilidad de utilizar diferentes modelos genéticos, incluidos los genes específicos ratones y tejidos específicos de genes diana de ratones (CRE-flox del sistema). Sin embargo, la isquemia renal murina es técnicamente difícil y detalles experimentales influyen significativamente en los resultados. Se realizó una evaluación sistemática de un nuevo modelo para la oclusión de la arteria renal aislada en ratones, que específicamente se evita el uso de sujeción o sutura de los ¹⁴ pedículo renal. Este modelo requiere de una nefrectomía del riñón derecho ya que la isquemia puede ser realizado en un riñón debido a la configuración experimental. De hecho, mediante el uso de un sistema de suspensión de peso, la arteria renal es sólo una vez instrumentado a través del procedimiento quirúrgico. Además, no hay obstrucción venosa o la uretra se produce con esta técnica. Nosotros pudimos demostrar el tiempo-dependiente de la dosis y altamente reproducible lesiones renales con isquemia mediante la medición de la creatinina sérica. Por otra parte, al comparar este nuevo modelo con sujeción convencional de toda la protección de pedículo renal por precondicionamiento isquémico es más profundo y más confiable. Por lo tanto, su nueva técnica podría ser útil para otros investigadores que trabajan en el campo de la insuficiencia renal aguda.

Protocolo

Observaciones generales. Todas las operaciones deberán realizarse bajo un microscopio vertical de disección (Leica) y utilizando un coagulador quirúrgico. Los ratones en los grupos experimentales deben coincidir en edad y peso para asegurar la comparabilidad de los resultados. Administración de la temperatura, la presión arterial, la anestesia y el líquido debe ser estable y controlado durante el experimento.

1. Anestesia y la cirugía

1. Experimentos de isquemia renal puede realizarse de manera simultánea la aplicación de la isquemia y reperfusión en ambos riñones, o después de la nefrectomía simple en combinación con el tratamiento de la isquemia del riñón restante. Como tratamiento de la isquemia bilateral de ambos riñones se asocia con un aumento de las dificultades técnicas, un entorno más complejo y experimental ya la cirugía, vamos a realizar una nefrectomía derecha seguido de un tratamiento de isquemia del riñón izquierdo restante mediante la utilización de un sistema de peso que cuelga. Hemos utilizado este sistema de peso que cuelga también a la oclusión de las arterias coronarias en el corazón. Sin embargo, el procedimiento es diferente, ya que la arteria renal puede ser aislado de los tejidos circundantes, mientras que la arteria coronaria se encuentra en el músculo del corazón.
2. Ratones (8-14 semanas de edad, ambos sexos) se anestesiaron con pentobarbital a una dosis de 70mg/kg. Vamos a mantener la anestesia con aprox. 10 mg / kg / h de sodio pentobarbital. La sobredosis puede reducir significativamente la presión arterial y por lo tanto puede alterar los resultados. En nuestros estudios iniciales que también se utiliza la ketamina y xilazina. Sin embargo, estos compuestos induce una bradicardia fuertes (150 / min). Junto a la bradicardia observada también hay evidencia de que ambos compuestos están involucrados en los mecanismos de protección en condiciones de isquemia. Los anestésicos volátiles no puede ser utilizado debido a su capacidad para inducir también la protección renal y presión arterial baja. Por lo tanto, nuestra elección final de la anestesia fue pentobarbital. Además, la ketamina y xilazina se excreta principalmente por vía renal. Nefrectomía y la isquemia puede prolongar la anestesia ketamina.
3. Una vez que el dolor reflejos están ausentes (probado por apretar los dedos del pie con pinzas) los ratones se colocan sobre una mesa de calentamiento con control de temperatura (RT, Effenberg, Munich, Alemania, para mantener la temperatura corporal de 37,0 ° C) en posición de decúbito lateral izquierdo.
4. Coloque las extremidades inferiores y superiores a la mesa con cinta.
5. Para los que no la supervivencia de las cirugías, como se muestra en el vídeo de demostración, cubra el área de la incisión con aceite mineral para evitar la inhalación de pelo del ratón mediante la reducción de la piel y evitar así el riesgo de alergias del pelo del ratón. En el caso de los experimentos de supervivencia de técnicas adecuadas de asepsia incluyendo recorte del vello, la desinfección de la piel con los yodóforos (Betadine, por ejemplo), el manejo de los instrumentos esterilizados en autoclave y el uso de máscaras una guantes estériles para el cirujano se requieren. El aceite mineral no se utiliza en las cirugías de la supervivencia. Para las cirugías de supervivencia estéril de NaCl se utiliza
6. Incisión en el flanco derecho se llevará a cabo con una tijera y un electrodo de coagulación (Erbe, ICC50, Alemania) para prevenir el sangrado de los músculos y vasos de la piel. En contraste con el acceso a los riñones a través de laparotomía media, esta técnica no requiere el acceso a la cavidad peritoneal.
7. El pedículo renal, incluyendo la arteria renal y vena renal se ligan con sutura 4 / 0 de seda y el riñón derecho se pueden cortar con una tijera, sin interferir con los vasos suprarrenales.
8. La herida quirúrgica se cierra con sutura continua (dos puntos) de la pared muscular y la piel con una sutura de 4 / 0.
9. Los animales se colocan en una posición de decúbito lateral derecho y una incisión en el flanco izquierdo se realizará.
10. El riñón izquierdo se retira cuidadosamente de los tejidos conectivos, evitando la glándula suprarrenal y los vasos.
11. A continuación, el riñón se activa con su lado ventral hacia abajo en una taza de lucita. La copa de lucita debe ser esterilizado para las cirugías de supervivencia. El polo del riñón es cuidadosamente introduce dentro del vaso de lucita sosteniendo el tejido circundante con una pinza. A partir de entonces el polo es cuidadosamente introduce dentro del vaso lucite con una pinza. El riñón se mantendrá húmedo y cálido, con un hisopo húmedo empapado con agua a 37,0 ° C.
12. Tras la exposición del riñón izquierdo y la colocación en una taza de lucita el titular del riñón es restringido vientre para tener la tensión en los vasos renales. Una restricción suficiente es importante para una exitosa colocación de la sutura en la arteria renal. Posteriormente, el titular de los riñones es fija y la arteria renal se puede identificar fácilmente ya que se ejecuta en la parte superior de la vena renal.
13. La arteria renal se diseca los tejidos adyacentes, cerca de su despegue de la aorta abdominal con unas pinzas finas. La arteria se diseca la vena subyacente con una pinza curva en la parte superior.
14. Una sutura 8 / 0 de seda (Ethicon, Norderstedt, Alemania) se coloca debajo de la arteria renal mediante el uso deuna pinza como guía principal. Esta técnica permite la interrupción de sólo el flujo de sangre arterial al riñón sin compresión de la vena renal, en comparación con el cierre del pedículo renal.
15. La sutura se coloca sobre un palo pequeño (puede ser un pin de seguridad, elaborado) y un peso de aprox. 1 g se adjunta a cada extremo (tubo eppendorf). El peso se puede adaptar al tamaño del riñón mediante la suscripción o la adición de agua en los tubos eppendorf. Sin embargo, la arteria debe ser un poco tirado hacia arriba, de modo que no hay sangre corriendo a través de la arteria, pero sin estirar importante en la arteria. Estrés tramo importante de la arteria puede causar daño de la pared vascular con engrosamiento de la pared arterial y reduce la reperfusión.
16. Mientras que los pesos no son compatibles, la arteria renal es inmediatamente obstruida. Por el contrario, cuando los pesos son compatibles, el flujo sanguíneo se restaura inmediatamente a los órganos. La oclusión exitosa se confirma mediante un cambio de color de rojo a blanco.
17. Diferentes tiempos de isquemia se pueden realizar como es requerido por el experimento. A la reperfusión completa se llevará a cabo en función de la duración del tiempo de isquemia. Los tiempos de isquemia de 45 minutos permite recuperar la lesión renal. En nuestra configuración experimental se utilizaron 20 a 30 minutos de isquemia debido a una lesión renal medio que nos permite ver la mejora, así como la afectación de los riñones en función de la cepa de ratón y el tratamiento.
18. Después de la reperfusión completa del riñón puede ser sustituido de la Copa de lucita. Por lo tanto, el titular de riñón no es fija y la tensión en el riñón se libera. El polo craneal se quita suavemente fuera de la taza con una pinza suave y el polo caudal sigue inmediatamente.
19. La fijación (cintas) del ratón puede ser puesto en libertad y el ratón se puede colocar en posición supina, por ejemplo, para FITC-inulina autorización etiquetados.
20. En los subgrupos de los experimentos, la presión arterial y el ritmo cardíaco puede ser grabado a lo largo de la intervención quirúrgica. Mediciones de presión arterial son obtenidos de forma continua a través de un catéter en la arteria carótida. En resumen, la arteria carótida se expone a través de una disección roma de los músculos paratraqueales. Después de la exposición y evitar más cuidado de trauma de los tejidos (especialmente del nervio vago), se inserta un catéter en el vaso con dos puntos de sutura y una pequeña abrazadera. La presión arterial se mide con un elemento Statham (WK 280, WKK, Kaltbrunn, Suiza).
21. Por FITC aclaramiento de inulina de un catéter tiene que ser colocado en la vena yugular izquierda para perfusión de cloruro de sodio y la inulina marcada con FITC. Además, un catéter en la vejiga tiene que ser insertado para la recolección de orina de una manera dependiente del tiempo, como se explica en detalle a continuación.

2. Medición de la lesión renal

1. En general: Los parámetros de resultados se recomienda lo siguiente para determinar el daño del riñón después de la isquemia renal:
   Realizar marcado con FITC aclaramiento de inulina para evaluar la tasa de filtración glomerular (TFG). Como alternativa determinar el aclaramiento de creatinina y la creatinina sérica a través de la investigación jaula metabólica 24 horas después de la lesión renal. Realizar renal tinción H & E y la mieloperoxidasa (MPO) de ELISA para determinar el daño renal y la inflamación 24 horas después de la isquemia renal.
2. Investigaciones metabólicas jaula:
   1. Después de una isquemia del riñón izquierdo se convirtió de nuevo en la posición retroperitoneal y la herida se cierra como se describió anteriormente.
   2. Al final de la cirugía de los ratones recibir 0,3 ml de solución salina normal IP y recuperar durante 2 horas bajo una lámpara de calentamiento.
   3. A partir de entonces los ratones se colocan en jaulas metabólicas (Tecniplast Deutschland, Hohenpeissenberg, Alemania) para la determinación de los parámetros funcionales renales de 2 tiempos de 24 horas.
   4. La toma de agua de cada ratón tiene que ser determinada por el peso del envase vacío y lleno de agua antes de su entrega al ratón y más de 24 horas más tarde por el peso del frasco lleno de nuevo. El peso del ratón ha de determinarse también.
   5. Después de 24 horas aproximadamente 75μl de sangre se toman del plexo venoso detrás del ojo a través de un tubo capilar bajo anestesia isoflorane corto.
   6. La función renal se determina mediante la medición de la creatinina en orina y plasma 24 horas después de la isquemia renal mediante un método colorimtric disponibles en el mercado de acuerdo con el fabricante `s del protocolo (LT-SYS, Trabajo + Technik, Berlín, Alemania). Las concentraciones plasmáticas y la orina de Na ^+, K ⁺ se determinan con un fotómetro de emisión de llama (ELEX 6361, Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania). Excreción renal y valores hemodinámicos se calculan utilizando fórmulas estándar ^15-17.
3. La depuración de inulina: FITC-inulina experimentos autorización se llevará a cabo tras la isquemia renal.
   1. La vena yugular izquierda se canula para continua infusion. Después de la disección de la vena del tejido adyacente con una tijera de preparación (Dumont, WPI) colocar dos puntos de sutura (4 / 0) alrededor de la vena. Coloque una pinza en la vena antes de la sutura proximale para detener el flujo de sangre. A partir de entonces cerrar el nudo distal y colocar un peso en uno de los extremos distales de sutura a la tensión la tensión en la vena. Esto es muy importante para obtener el catéter en la vena. Use un micro-tijeras para cortar una pequeña abertura en la vena. Mantener la apertura con una pinza fina (Dumont, IPM) y colocar el catéter en la vena. Para avanzar el catéter Remueva la pinza. Asegúrese de que no hay tensión en la sonda de modo que se puede colocar hacia abajo sin que lo sostiene. A partir de entonces cerca de la segunda sutura proximal sobre la vena y el catéter.
   2. Se coloca un catéter en la vejiga urinaria para la recogida programada de orina. Por lo tanto, se corta una pequeña incisión en la piel sobre la vejiga. Retire con cuidado la vejiga a través del agujero de la piel. Fijar la vejiga con un pañuelo húmedo. Colocar una sutura preparado a lo largo de la vejiga (4 / 0).
   3. Corte un pedazo pequeño de un catéter (1,5 cm) y el calor en el extremo de conseguir un anillo alrededor del catéter que hace más fácil para arreglarlo en la vejiga.
   4. Corte un agujero en la vejiga en su parte superior. Hacer el corte entre los vasos para prevenir el sangrado. Introduzca el extremo grande del catéter en la vejiga y el cierre de la sutura sobre el catéter y la vejiga.
   5. Todos los ratones reciben un bolo de solución de cloruro de sodio al 0,85% en una cantidad igual al 20% del peso corporal. La infusión continua se mantiene a un ritmo de 800ul/h/25g peso corporal y FITC-inulina se agrega a la infusión para la evaluación de la tasa de filtración del riñón entero glomerular (TFG). Después de la estabilización de los animales durante 20 min, 20 min muestras de orina de tiempo se llevan a cabo (cuatro veces) para la determinación de la tasa de flujo urinario y FITC-inulina. La sangre se obtiene en la mitad de cada período de medición de la FITC-inulina.
   6. Al iniciar el período de recogida de 20 minutos de uso de un temporizador. Recoger la orina colocando el extremo de la sonda vesical en un pequeño tubo eppendorf. Medir el peso del tubo antes y después de la recolección de orina para que pueda determinar la cantidad de orina. Las muestras de sangre se toman a través del formulario de recogida de sangre retroorbital el plexo venoso a través de tubos capilares en el centro de cada período de recolección.
4. La sangre y el riñón se pueden recoger después de cada procedimiento para más análisis ELISA MPO, por ejemplo, citoquinas EISA, la histología.

3. Los resultados representativos:

Figura 1 Modelo de un sistema de suspensión de peso para la isquemia renal. Un sistema de peso que cuelga se ha establecido para inducir isquemia renal del riñón izquierdo. Por lo tanto, una sutura de nylon 8,0 se coloca debajo de la arteria renal y al final de cada sutura un peso pequeño (1 g) se adjunta. Este diseño experimental permite la oclusión reversible de la arteria renal mediante la aplicación y la liberación de la carga de peso.

Discusión

En resumen, el estudio describe una nueva técnica para la realización de la isquemia renal en un modelo murino utilizando un sistema de suspensión de peso para la oclusión de la arteria renal. De hecho, este estudio demuestra una lesión altamente reproducible, lo que reduce la variabilidad asociada con la fijación del pedículo renal.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pentobarbital sódico	Ls Vortech Farmacéutica, SA	VPL 9372	4mg/mL en solución salina
Sutura de seda 4.0	Harvard Apparatus	517698
Sutura de Prolene 8.0	Ethicon, EE.UU.	M8739	reutilizables
microscopio de disección	Leica	n / a	considerar la distancia amplia zona de trabajo
Calefacción Mesa	Rt, Effenberger, Alemania	n / a	único proveedor y una sola
Los instrumentos quirúrgicos	WPI, Dumont		una tijera bien microvasos