Alta densidad de registros de EEG de los ratones se mueven libremente con poliamida basado microelectrodos

Resumen

En este artículo se describe el procedimiento de la cirugía y el manejo de consejos para la implantación de ultra-delgada serie de microelectrodos de poliamida basado en (PBM-matriz) en el cráneo del ratón para la adquisición de alta densidad encefalografía (EEG) en un modelo murino.

Resumen

Electroencefalograma (EEG) indica el promedio de la actividad eléctrica de las poblaciones neuronales a nivel de gran escala. Es ampliamente utilizado como una herramienta de monitorización no invasiva del cerebro en la neurociencia cognitiva, así como una herramienta de diagnóstico para los trastornos de la epilepsia y el sueño en neurología. Sin embargo, el mecanismo subyacente de la generación del ritmo EEG está todavía bajo el velo. Introducido recientemente poliamida basado en microelectrodo (PBM-array) para el ratón de alta resolución EEG ¹ es uno de los ensayos para responder a las preguntas sobre las señales neurofisiológicas EEG sobre la base de una riqueza genética que contiene el modelo de ratón para el análisis del complejo proceso de generación de EEG. Esta aplicación de nanofabricados PBM-array al cráneo del ratón es una herramienta eficiente para la recolección a gran escala la actividad cerebral de ratones transgénicos y tiene capacidad para identificar las correlaciones neurales de ciertos ritmos EEG en relación con el comportamiento. Sin embargo, su diseño ultra-fino espesor y la estructura bifurcada causar problemas en el manejo e implantación de PBM-matriz. En el video presentado, los pasos de preparación y la cirugía para la implantación del PBM-array en un cráneo del ratón se describen paso a paso. Consejos sobre la manipulación y la cirugía para ayudar a los investigadores tener éxito en la implantación también se proporcionan.

Protocolo

1. Resumen

C57BL/6J - 129S4/SvJae ratones híbridos (12 ~ 15 semanas de edad) son anestesiados con ketamina (120 mg / kg ip) y xilazina (6 mg / kg, ip) de cóctel. Pellizcar la cola o del pie precede a la cirugía para inspeccionar la profundidad de la anestesia. El ratón es fijado por un aparato estereotáxico (David Kopf Instruments, modelo 902, California, EE.UU.). El cuero cabelludo se realiza una incisión en la línea media de unos 25 mm para exponer el cráneo en el tratamiento de lidocaína para reducir el dolor. Todos los residuos en el cráneo es borrado por puntas de algodón empapada en solución salina para mejorar la adherencia de los electrodos en el cráneo. Los puntos de bregma y lambda están marcadas y establecidas en el mismo plano horizontal. La poliamida amplia base de microelectrodos (PBM-matriz) se coloca de modo que su línea media vertical cumple con la línea media del cráneo. El punto de bregma debe estar ubicado en el centro de la capa de 5 ^º de la parte anterior del PBM-matriz. Dos o tres microtornillos se utilizan en el espacio nulo en el borde del cráneo para ayudar a asegurar la posición de los electrodos con cemento dental. Para apuntalar el conector PBM-matriz, la posición de un puntal en el centro de la cabeza, y se cubre con cemento dental. Después de curar, la piel incisión se sutura, y al menos 5 días se dan para la recuperación. Durante la recuperación, los ratones son alojadas en jaulas individuales con libre acceso a comida y agua. Después de la recuperación, el registro EEG se lleva a cabo. Los procedimientos de cuidado de los animales, quirúrgicos y de grabación estaban en conformidad con las directrices para el Cuidado de Animales institucional y el empleo, a raíz de la Ley 1992 del Reglamento de Corea del Cuidado de Animales de Laboratorio y las directrices correspondientes. Las matrices de PBM-en este manuscrito fueron fabricados como se describe por Choi. et. al ^1. Póngase en contacto con los autores de la misma PBM-matriz en el video.

2. Procedimiento

1. Preparar los instrumentos esterilizados y aparatos estereotáxica.
2. Anestesiar el ratón con la anestesia (por ejemplo, la ketamina / xilazina con una dosis de 120 y 60 mg / kg ip, respectivamente). Pellizcar la cola o del pie precede a la cirugía para inspeccionar la profundidad de la anestesia.
3. Monte el ratón sobre el aparato estereotáxico mediante la colocación de barras de oído en el conducto auditivo del ratón y apretando en su lugar. Los ojos se pueden cubrir con la jalea biocompatible (por ejemplo, la jalea de petróleo) para mantener los ojos se sequen por la luz de la cirugía. Después de la hidratación cabeza del ratón con el 70% de etanol, se afeitan el pelo de su cabeza.
4. Incisión en la cabeza cerca de 25 mm con un cuero cabelludo. Es recomendable aplicar una pequeña cantidad de clorhidrato de lidocaína al 2% en el cuero cabelludo. Pellizcar la piel con pinzas de micro (Herramientas Artes Ciencias (EE.UU.), Inc., 18052-03, California, EE.UU.) para mantener la incisión abierta.
5. Limpie cualquier resto de tejido que queda en el cráneo con una solución salina, torundas de algodón empapadas mejorar la adherencia de la PBM-matriz a la cabeza. El uso de peróxido para eliminar el residuo de la membrana es también eficaz.
6. Encontrar el bregma y lambda puntos en el cráneo, y marcarlos con un lápiz marcador a base de aceite. Coloque el PBM-matriz de modo que su línea media vertical cumple con la línea media del cráneo, como se muestra en la Figura 1. La posición del bregma en el centro de la capa de 5 ^º de la parte anterior del PBM-matriz con una gota de agua del grifo. Limpiar el electrodo de la película de medial a lateral con cuidado para una mejor adherencia. Con el fin de ayudar al electrodo de película estrecha palo en el cráneo, el electrodo de película debe estar completamente seco en el cráneo. El electrodo de película aún no se ha fijado en el cráneo de van der Waals fuerza. Cuando el cambio de posición del electrodo, una gota de agua de la llave es necesaria para evitar que el electrodo está roto.
   
   Figura 1. (Izquierda) Una PBM-matriz en el cráneo del ratón. El eje anterio-posterior del PBM-serie coincide con la línea entre el bregma (BP) y los puntos de lambda (LP). (Derecha) La posición de los electrodos en la superficie del supuesto cerebro del ratón. La anatomía del ratón están segmentados de la base de datos 3-D MRI atlas digital de un cerebro de ratón adulto C57BL/6J producidos en el Laboratorio Nacional de Brookhaven y la ubicación de electrodos están marcados de acuerdo a la medición estereotáxica. Suelo (G) y referencia (Ref) electrodos están marcados en la figura de la derecha.
7. Marque por lo menos tres posiciones en el área abierta del cráneo, y luego hacer los agujeros en los lugares con un taladro dental para la colocación de los microtornillos de apoyo. Estos microtornillos tienen un papel de puntal y mecánicamente apoyar el cemento dental en el cráneo. Precaución adicional que se necesita durante la perforación. Desde el cráneo del ratón se compone de capas finas, la hemorragia puede ocurrir fácilmente durante la perforación. Cuando la hemorragia ocurre, deje de taladrar y aplicar una pequeña cantidad de polvo hemostático en el agujero.
8. Aplique el cemento acrílico dental (Vertex-Dental, Vertex auto-curación, Países Bajos) para cubrir el PBM-matriz, tornillos de anclaje, y el resto del cráneo. Preparar el cemento dental en una c pegajoso y viscosoONDICIÓN.
9. Posición de un palo rígido como un puntal en el centro de la cabeza con pegamento fuerte (por ejemplo, Loctite, Henkel Loctite Corporation, Dublín, Irlanda). Ponga cinta de doble cara adhesiva en la parte trasera del avión conector. Manipular la posición del conector PBM-serie para conectar con la punta de la costilla. La distancia vertical entre el cráneo y el conector debe ser superior a 5 mm. Pegue el plano del conector y la punta de la vara con pegamento fuerte para una mejor adherencia.
10. Asegúrese de que el cemento dental es completamente curado. A continuación, aplique el cemento dental de acrílico sobre el cráneo y la parte trasera del avión conector para asegurar el conector en el cráneo.
11. Retire las abrazaderas de micro. Sutura una incisión de piel con costuras de fibra esterilizada. Quitar el ratón del aparato. Usted puede aplicar el cemento acrílico dental adicional para proteger el cráneo al descubierto. Aplicar un antibiótico (pomada fucidin, Dong Wha Farmacia, Corea del Sur) en todo el cemento y la piel suturada.
12. Coloque el ratón en una jaula esterilizada hasta que recupere su peso original (aproximadamente de 5 a 7 días). Se recomienda no introducir los compañeros de jaula.
13. Después de la recuperación, conectar el ratón por una ligera placa de circuito impreso (PCB), conector de la caja de entrada de un sistema de amplificador multicanal EEG (SynAmps ^2, Carolina del Norte, EE.UU.) en su propia jaula. Las líneas de conexión debe ser tratada con cuidado para que no se enrede.
14. Después de 1 hora de habituación, de realizar la grabación del EEG. Exploración 4.4. (Carolina del Norte, EE.UU.), adquisición de software se utilizó en este experimento. Un conjunto de traza en tiempo típico de ratón EEG se muestra en la Figura 2. Se recomienda registrar el vídeo a relacionar el comportamiento del ratón.
15. Señal obtenida puede ser analizado por MATLAB (The Mathworks, Natick, MA, EE.UU.) para producir el mapa topográfico del cerebro. Topografías muestra de mapa de potencia del EEG del cerebro del ratón se muestran en la Figura 3.

3. Resultados representante

Si por encima de los procedimientos quirúrgicos son realizados correctamente, la grabación de 40 canales de EEG del ratón se realizó con éxito, sin canales de malo. Siguientes figuras muestran el representante rastros EEG y mapas topográficos.

Figura 2. Un seguimiento de la muestra de convulsiones EEG ausencia experimentando inducida por la inyección γ-butirolactona (GBL, 50mg/kg, ip). Barra roja indica punta-onda y descargas (SWDs) durante la crisis de ausencia. Los ejes horizontales y verticales indican el tiempo y la tensión, respectivamente. El número sigue al montaje de los canales definidos en la figura. 1 (derecha).

Figura 3. Los mapas topográficos indica la distribución 06/02 Hz el poder. El valor de la barra de colores representa la escala de colores del mapa de poder. Durante el pico de la onda y descargas (SWDs) inducido por γ-butirolactona (GBL, 50mg/kg, ip), el poder en las regiones corticales frontoparietal grandes aumentan significativamente en comparación con el poder antes de la inyección GBL (nivel básico).

Discusión

Aquí mostramos los procedimientos quirúrgicos y el registro de la adquisición de EEG de alta densidad en los ratones se mueven libremente. Este método nos permite obtener mapas funcionales cerebrales a partir del modelo de ratón para estudiar los mecanismos moleculares de ^1,2 espontánea rítmica o actividades relacionados con eventos cerebro.

Adquisición de todos los canales en el PBM-matriz es una condición necesaria para obtener la cartografía de todo el cerebro, sin embargo hacer un contacto seguro para cada canal es muy difícil. Para mantener el contacto constante del canal en el cráneo, los siguientes procedimientos se encuentran para ser importante. En primer lugar, los restos de tejido en el cráneo puede establecer además el electrodo de la cabeza. Por lo tanto es muy importante eliminar todos los restos de tejido con hisopos de algodón esterilizado y seco hasta la superficie del cráneo. En segundo lugar, la capacidad de PBM-array que puede pegarse a la superficie del cráneo se van der Waals fuerza. Se sugiere que se aplique una gota de agua del grifo en el cráneo para construir una capa de agua antes de aplicar PBM-matriz a la cabeza. En tercer lugar, la viscosidad del cemento dental es muy importante. Si es demasiado líquido, puede crear una capa aislante bajo la PBM-matriz. Si es demasiado densa, el cemento dental fácilmente se vendrá abajo en el cráneo debido a su propio peso. Por último, por lo menos tres microtornillos de apoyo deben ser implantados en el cráneo para que el cemento dental fuertemente unida al cráneo. Los microtornillos apoyo sostener el cemento dental y asegurar la headstage, que es esencial para el estudio a largo plazo.

La aplicación de PBM-matriz se limita a estudio crónico con ratones adultos debido a su tamaño y peso. Basándonos en nuestra experiencia, los ratones de más de 25 g son adecuadas para su uso. Como otras aplicaciones, a través del espacio nulo entre las ramas de nuestro PBM-matriz, se puede introducir electrodos secundarios para la grabación o el propósito de estimulación.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
γbutyrolactone	Sigma-Aldrich	H7629-500G