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Method Article
Una demostración formal de la disección de un ojo del ratón, lo que resulta en un montaje de todo el epitelio pigmentario de la retina.
El epitelio pigmentario retiniano (EPR) se encuentra en la parte posterior del ojo de los mamíferos, justo debajo de la retina neural, que contiene los fotorreceptores (conos y bastones). El EPR es una monocapa de células pigmentadas cúbicas y asociados estrechamente con la retina neural justo encima de él. Esta asociación hace que el RPE de gran interés para los investigadores que estudian enfermedades de la retina. El EPR es también el sitio de un ensayo in vivo de la homología dirigida por la reparación del ADN, la prueba de p de la ONU. El ojo del ratón es particularmente difícil de analizar debido a su pequeño tamaño (alrededor de 3,5 mm de diámetro) y su forma esférica. En este artículo se demuestra con todo detalle un procedimiento para la disección del ojo que resulta en un montaje conjunto de la RPE. En este procedimiento, se muestra cómo trabajar con y no contra, la estructura esférica del ojo. En pocas palabras, el tejido conectivo, el músculo y el nervio óptico se eliminan de la parte posterior del ojo. Luego, la córnea y el cristalino se eliminan. A continuación, se hacen cortes estratégicos que dan lugar a aplanamiento significativo del tejido restante. Por último, la retina neural se levanta suavemente, dejando al descubierto un EPR intacto, que aún está unido a la coroides y la esclera subyacente. Este monte se puede utilizar para realizar el ensayo de la ONU o p para la evaluación de inmunohistoquímica o inmunofluorescencia el tejido de RPE.
1. Eliminar el tejido extraños desde el exterior del ojo
2. Retire la córnea y el cristalino
3. Trimestre el ocular como resultado, lo que resulta en un 4 - "pétalos", la flor-como la estructura
4. Corte cada uno de los cuatro "pétalos" en la mitad, resultando en un niño de ocho pétalos de flores-como la estructura
5. Retire la retina neural
6. Montaje que muestra (s) en una diapositiva
7. Los resultados representativos:
El resultado de este procedimiento debe ser una estructura que se parece a una flor y debe ser bastante simétricas.
Figura 1. Todo RPE montaje de un ratón de tipo salvaje C67Bl/6J. RPE de color negro o agouti animales debe ser de color marrón oscuro y debe tener una superficie lisa. Es normal observar ondulaciones en la topografía de los pétalos. La pigmentación en cualquier muestra de dar puede ser algo variable, debido a la densidad variable de pigmentación tanto de la EPR y la coroides subyacente. Las flechas blancas señalan hipopigmentadas "canales" - esto es normal y es debido a la vascularización subyacente del ojo. Puntos de flecha azul a los daños físicos tanto a la EPR y la coroides subyacente.
Figura 2. Todo RPE montaje de un ratón diluido. Muestras recolectadas de animales diluidos puede variar en color de casi transparente a café con leche y cualquier espécimen es como tener la variabilidad dentro de ella, se indica en los círculos negro aquí. En general, RPE cosecha de los animales más jóvenes son más ligeros y los cosechados de los animales más viejos son más oscuras. Flechas de color negro indican algunos de los vasos subyacentes, que aparece hipopigmentadas.
Figura 3. Tinción phalloidin se puede utilizar para detectar daños físicos a la RPE. Tinción faloidina define claramente las membranas celulares, mostrando la forma hexagonal del epitelio. (A) Ejemplo de un ratón negro. (B) Ejemplo de un ratón diluido.
Figura 4. Un RPE mal disecado de un ratón diluido. (A) Los corchetes indican los márgenes de la córnea que son demasiado grandes, que pueden causar la deformación y / o plegables. Dentro del círculo negro se puede ver una cantidad excesiva de tejido extraño que no se han retirado de la parte posterior del ojo. Son particularmente evidente, porque la muestra es de un animal diluido. El pétalo de abajo a la izquierda está parcialmente doblada. (B) Este monte se tiene la apariencia de un molinillo de viento. Flechas de color negro indican algunos de los cortes que se hicieron. Muchos de los cortes de la brecha corneo-escleral hacia la cabeza del nervio óptico no están en línea con el diámetro. (C) flechas Negro indican cómo los recortes que se han hecho, de acuerdo con el diámetro y la perpendicular a la tangente.
El EPR es el sitio de la prueba de p de la ONU, un ensayo in vivo de la homología dirigida reparación. El ensayo de p de la ONU ha sido utilizado para estudiar los efectos de los daños del ADN diferentes 1,2 y señalización daño en el ADN y los genes de reparación 3,4,5 de la frecuencia de homología dirigida reparación. Este ensayo es muy sensible, la detección de una sola célula eventos en el RPE 1. También puede detectar difer...
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental [K22ES012264 a AJRB] y una Sociedad Americana del Cáncer InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173-04] piloto projectaward [a AJRB]. También queremos agradecer a los miembros del laboratorio de obispo para la lectura crítica del manuscrito y comentarios sobre el vídeo y Brown Adán, en particular, por el ejemplo de qué no hacer. Agradecemos al Dr. Donald McEwen del Cáncer del Instituto de Investigación de Niños Greehey por permitirnos el uso de su microscopio de disección / cámara de video puesta a punto para el rodaje del vídeo de la disección. Damos las gracias a Daron Brown en Instrumentos Corte para el afilado y reparación de nuestras herramientas de microdisección.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
straight forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4903 | tip: .08 x .04 mm material: INOX |
45° forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5005 | tip: .05 x.01 mm material: INOX |
15° "up" forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045A | tip: .1 x.06 mm material: INOX |
spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5604 | comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel |
binocular dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | Discovery V.8 | use reflected light source |
phalloidin | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 |
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