Demostrando la Utilización del Espectrómetro de Novela de la Fuerza gravitacional para estirar y medir las proteínas fibrosas

Resumen

Se trata de un paso a paso guía que muestra el propósito, el funcionamiento y los resultados representativos de la fuerza de la gravedad del espectrómetro novela.

Resumen

El estudio de la estructura macromolecular ha convertido en crítico para la elucidación de los mecanismos moleculares y la función. Hay varios bioinstruments limitada, pero importante, capaz de probar la dependencia de la fuerza de las características estructurales de las proteínas. Escala ha sido un parámetro de limitación en la precisión investigadores pueden mirar en el mundo nanomecánicos de moléculas, tales como ácidos nucleicos, enzimas y las proteínas motoras que realizan para mantener la vida de trabajo. Microscopía de fuerza atómica (AFM) está bien afinado para determinar las estructuras nativas de proteínas fibrosas con una resolución de la distancia a la par con el microscopio electrónico. Sin embargo, en estudios de AFM fuerza, las fuerzas son generalmente mucho mayor que una sola molécula puede experimentar ^{1, 2.} Trampas ópticas (OT) son muy buenos en la determinación de la distancia relativa entre los granos atrapados y pueden transmitir fuerzas muy pequeñas ^3. Sin embargo, no precisa el rendimiento longitud absoluta de las moléculas bajo estudio. Simulaciones moleculares proporciona información de apoyo para estos experimentos, pero están limitados en la capacidad de manejar el mismo de gran tamaño molecular, cuadros de largo tiempo, y convencer a algunos investigadores, en ausencia de otras pruebas de apoyo ^{2, 4.}

La fuerza gravitacional del espectrómetro (GFS) llena un nicho importante en el arsenal de un investigador al ofrecer una combinación única de habilidades. Este instrumento es capaz de generar fuerzas típicamente con un 98% o mayor precisión de la gama femtonewton a la gama nanonewton. Las mediciones de distancia en la actualidad son capaces de resolver la longitud molecular absoluta a cinco nanómetros, y la relativa distancia de separación de cuentas par con una precisión similar a una trampa óptica. Además, la GFS puede determinar el estiramiento o desenrollar en donde la fuerza está cerca del equilibrio, o proporcionar una fuerza gradual de yuxtaponer contra cualquier cambio estructural medido. Incluso es posible determinar el número de residuos de aminoácidos están involucrados en desenrollar eventos bajo cargas de fuerza fisiológica ^2. A diferencia de otros métodos de calibración donde hay fuerza amplia que debe preceder a cualquier ensayo, el GFS no requiere de calibración tal fuerza ^5. Al complementar las fortalezas de otros métodos, la EFP cerrar las brechas en la comprensión de la nanomecánica de proteínas vitales y otras macromoléculas.

Protocolo

Introducción a la configuración de nuevos GFS

Las EFP se compone de varios componentes esenciales: un microscopio de luz normal, una montura ecuatorial, una cámara y un ordenador [Figura 1]. El sellado de flujo células en la cámara que contiene la muestra es también indispensable de acuerdo con el diseño de las EFP. El microscopio de luz se monta en la montura ecuatorial por lo que el alcance se puede rotar en diferentes orientaciones en el espacio. Esta capacidad permite que el vector de la gravedad estática para ser explotados de manera que las muestras pueden ser de orientación dinámica en relación con el vector por lo que la fuerza de la gravedad puede impartir picoNewton alcance cargas de fuerza a las muestras. La cámara sustituye a la lente del microscopio óptico ocular de lo que se puede registrar los cambios en la orientación de la muestra. Estos datos en bruto es digitalizada y manipulada por la computadora para interpretar los datos en la fuerza real y las mediciones de distancia. El sellado de flujo cámara está diseñada para permitir a todos los grados de libertad en el espacio sin pérdida de muestra. Reside en la cámara de la molécula de la muestra que está atado cerca de una terminal a un "ancla" de cuentas que se pega a la superficie de la cámara. El término opuesto es atado a un "móvil" de cuentas que está libre de la superficie de la cámara. Este es el móvil de cuentas, libre en el tampón de ensayo que se puede actuar por la fuerza gravitacional se extiende por lo tanto la molécula atados a tales cargas de baja fuerza [Figura 2]. La muestra simplemente se ve como un par de microesferas bajo el microscopio, a pesar de que hace falta un poco de experiencia para discernir el bien útil, junto pares por su adhesión a una molécula de parejas donde ambos talones están sentados en la superficie de la cámara de flujo. Una de las modificaciones al sistema es la adición de una plataforma flotante que tiene la GFS y es suspendido por resortes. En esta configuración, una vez que la muestra se ha girado hacia una posición en la fuerza de la gravedad puede actuar sobre la muestra, la plataforma y todos sus componentes se pueden quitar en contra de la constante del resorte. Cerca de caída libre, la fuerza que actúa sobre el cordón de móviles es cercana a cero y en la extensión máxima de las aguas, la fuerza de gravedad se multiplica por hasta dos veces. De esta manera, una graduada de fuerza / distancia de respuesta pueden ser graficadas para medir el comportamiento de una sola molécula en diferentes cargas de fuerza.

1. Preparación de las microesferas

1. Sumergir unos 10 mg de microesferas de vidrio o sílice en el 0,04% 3-aminopropiltrietoxisilano (corte con acetona) durante dos minutos.
2. Enjuague con dos cambios de agua destilada y se centrifuga para sedimentar a 2000 xg durante 5 minutos. Desechar el sobrenadante.
3. Añadir 5 ml de tampón de acoplamiento (0,01 M piridina corte con agua destilada y ajustar el pH a 6.0) y agitar la mezcla vigorosamente. Centrifugar como se describió anteriormente. Repita este paso tres veces.
4. De torta húmeda de granos, agregar 2 ml de solución de glutaraldehído al 5% (corte glutaraldehído con tampón de acoplamiento). Agitar enérgicamente.
5. Bajo una campana, gire mezcla de grano / glutaraldehído durante 3 horas a temperatura ambiente.
6. Centrífuga que el anterior, y aspirar el sobrenadante.
7. Lavado de los granos en 5 ml de tampón de acoplamiento agitando vigorosamente y se centrifuga y se aspira el sobrenadante. Repite esto tres veces más.
8. Añadir alrededor de 15 ul del anticuerpo deseado a los granos y agitar vigorosamente. Las cuentas se deben rotar durante 16-24 horas.
9. Bajo el capó, agregar 5 ml de una solución de enfriamiento M glicina (glicina corte con agua destilada y ajustar el pH a 7.0). Agite la mezcla vigorosamente y girar durante 30 minutos.
10. Centrifugar y aspirar el sobrenadante.
11. Añadir 5 ml de tampón de lavado (0,01 M Tris, pH 7,0; 0,1% de azida de sodio, 0,1% de BSA, 0,15 M NaCl y 0,001 M EDTA). Agitar enérgicamente este, se centrifuga y se aspira el sobrenadante. Repita este paso tres veces más.
12. Cambio de amortiguación de bajo contenido de sal tampón (0,1 M KCl, 0,02 M imidazol, 5 mM MgCl _2, ajustar a pH 7,0). Repita tres veces.

2. Muestra de apego a las microesferas

1. Tomar una pequeña cantidad de cuentas preparados (alrededor de 2 l de cada una torta de cuentas sin embargo, si hay una gran discrepancia entre los lotes de diámetro, es conveniente utilizar en torno a una relación 8:1 de grandes cuentas pequeñas) y añadirlos a un tubo de microcentrífuga con tampón de ensayo. Reducir la concentración de las proteínas a alrededor de 5 M, con el tampón de ensayo. Preparar al menos un volumen total de 400 l como el buffer, la proteína, y las perlas.
2. Gire esta mezcla en torno a 1 RPM durante 3 horas (si la proteína se agita demasiado, que se agregan y se vuelven inútiles).

3. Preparación de diapositivas Cámara

1. Capa de espesor un portaobjetos de microscopio con un 0,01% de nitrocelulosa (en acetato de amilo). Deje esta diapositiva en seco durante unos 10 minutos.
2. Con un cortador de vidrio afilado, corte tapa deslizante para hacer una cámara. Esto requiere de cuatro tiras de vidrio.
3. Usa el hecho deteoría borde de la copa y la comisión que a través de una mancha de grasa de vacío a ambos lados del borde.
4. Las tiras de prensa de grasa recubiertas nitrocelulosa seca cubierta de diapositivas para crear un cuadro en la superficie de la diapositiva.
5. Pipeta de 2 l de la mezcla de grano / proteína tocando pipeteador en la superficie de vidrio dentro de la caja.
6. Añadir alrededor de 20 a 400 l de buffer de baja en sal, dependiendo del tamaño de la cámara.
7. Pulse una hoja de la cubierta en la parte superior de la caja que ya está cubierto con grasa de vacío para finalizar la cámara sellada y protegida.
8. Dejó pasar sentarse en un lugar llano así que los granos tengan tiempo suficiente para anclarse a la nitrocelulosa.

4. GFS de Adquisición de Datos

1. Montaje de diapositivas en la etapa de EFP
2. Controlar lo que la cámara está grabando GFS y la búsqueda de legítima "pares de cuentas", en el que la microesfera delgado se une cerca del ecuador de la microesfera grande.
3. Cuando un par de bolas de potencial se encuentra, vaya a través de la profundidad de campo para determinar si el "móvil" de cuentas no se duerme en la superficie de la diapositiva.
4. Una vez que una pareja adecuada es identificado, tenga en cuenta el ángulo de cuentas móviles está lejos de _max d (d _max = la distancia máxima entre los centroides de las microesferas junto). Mueva el alcance en posición de adquirir video.
5. El ángulo de desplazamiento de la EFP debería ser suficiente para grabar d _{min, max} d, y la _vitamina D que se podría llamar de 25 a 90 grados, dependiendo de la longitud de la molécula.
6. RECORD como la pareja viaja de d a d _{min max} y volver a d _min.
7. Es una buena idea para filmar una película también de los antecedentes por lo que se puede restar más tarde para su análisis.
8. Si se realiza un descenso de EFP, mueva el alcance de nuevo a la densidad _máxima y registrar la caída de por lo menos a 60 cuadros por segundo. La parte crítica es la primera oscilación, pero los tiempos largos de grabación también se puede utilizar para el estudio dinámico.

5. GFS de análisis de datos

1. Transformar de vídeo en bruto en forma digital "un umbral" de la imagen y ejecutar macros en ImageJ para determinar la posición de centro de gravedad de cada cuenta en cada fotograma de vídeo. Esto también es para el vídeo de la gota.
2. Volcar la X, Y y los datos de área de ImageJ hacia Excel y representar los puntos.
3. Si un par de cuentas adecuada fue adquirido por el video, una joroba notable en el gráfico es un indicador de las cuentas que en su más cercano (d _min) y en el vértice de la gráfica es la posición de d _max.
4. Con estos datos, el radio de cada cuenta debe ser determinada con precisión en ImageJ y toda esta información se introduce en la ecuación anidados:
   d = [(g sen α) ² + (g cos α + d _max - g) ^{2] 0,5}
   g = [d _min ² + r _b ² - (R _a + r _b) ^2] = ^0,5 r _b sen β
   c = d _max - r _a - g
   (D = distancia entre centroides; g = fuerza de la gravedad; α = el ángulo en grados en paralelo a la lente del objetivo, r _b = radio del móvil de cuentas, _un r = radio de cordón anclado, el ángulo β = de unión fuera del eje de el ecuador de la anclado cuenta.
5. Utilizando el radio ajustado de la móvil de cuentas, que también da su volumen, y dada la densidad de la bola, la fuerza de la cuenta móvil imparte en la molécula se puede calcular en piconewtons después de la flotación del solvente se resta. Este método mide la fuerza de la molécula atados en piconewtons y calcula la longitud de la molécula absoluta entre los archivos adjuntos de anticuerpos en nanómetros. F = V (db) a (F = fuerza, V = volumen, d = densidad de las microesferas de vidrio, una aceleración = debido a la gravedad, b = la densidad del agua desplazada).

6. Los resultados representativos:

Si la preparación de cuentas se hace correctamente, no habrá acumulación de cuentas mínimo, aunque todavía puede haber un grupo de bolas de vez en cuando. Cuando se ve a través del endoscopio, debe haber una distribución razonable de cuentas si emparejado o no en la cámara.

Es importante para minimizar las vibraciones tanto como sea posible, para ello ya sea una mesa de aire, absorción de choque especial para los pies de un trípode que sostiene un montaje EQ, o en el sistema que utiliza muelles se puede utilizar para el aislamiento de vibraciones.

Otro consejo útil sobre la cámara de flujo cerrado es dejar reposar durante unos cinco minutos en una mesa de nivel después de haber sido totalmente construido. Esto permite que las bolas sueltas mayor a flotar a través de la memoria intermedia y el resto de la capa de nitrocelulosa. Si la tapa se monta en lugar directamente sobre la terminación, el investigador continuamente tienen que lidiar con los granos, literalmente, volando por el campo de visión, y si esto ocurre durante la adquisición de vídeo se puede corromper ªe experimento. Si esto se hace correctamente, la fuga de cordón es mucho más limpio y minimiza los resultados de vídeo.

Cuando un par de bolas potencial es identificado por el operador de EFP, es útil para poner a través de una rotación preliminar para vigilar el comportamiento de la pareja. Rara vez, la cuenta grande no está firmemente adherida a la diapositiva. Si esto sucede, no hay uso en la utilización de la pareja, ya que es fundamental que la mayor estancia cordón anclado en una posición fija durante la duración de la adquisición. Si la pareja es estable y no presenta "rollo de cordón anclado", entonces es adecuado para la experimentación.

Un gráfico de distancias de separación de cuentas frente a cambio en el ángulo con respecto a la gravedad se puede utilizar para evaluar los datos adquiridos. Un buen representante resultado mostraría poca separación en una meseta y como la cuenta móvil se libera de la cuenta anclado a causa de la influencia de la gravedad, el gráfico muestra una mayor separación. Esto continúa hasta que un buen pico se alcanza lo que se llama d _max y la curva empieza nuevamente a la baja de regresar a la línea de base d _min [Figura 1]. En condiciones ideales, esta firma es simétrica. Un resultado no sería representativa muestra un gráfico con los patrones incoherentes que no muestran distintas d _min-max d-d patrón _min, o sería una muestra de separaciones que son órdenes de magnitud demasiado elevada para una sola molécula que indica que tal vez había una mota de polvo entre las cuentas, o tal vez que el cordón de móviles no se sujeta fácilmente a todos. El proceso de encontrar el par, el tiro que, procesarla, analizarla y tiene muchos vacíos que deje inadecuado pares de cuentas son sacrificadas a cabo. Así que, si llega al final de todo el proceso y tiene una longitud de la molécula que sea consistente con los resultados anteriores, se puede estar muy seguro de que el par de bolas original es representativa y se pueden incluir en los resultados. En un buen día, aproximadamente la mitad de la toma pares de cuentas se pueden tomar a través de convertirse en un punto de datos legítimos. Por ejemplo, la longitud de la espiral de la bobina de la miosina entre MF20 MF30 y anticuerpos, que se conoce sobre la base de datos de EM y AFM, los datos de acercarse a 100 nm ^2,7,8,9. Si el resultado es varias veces esta longitud, la muestra ha agregado. Los resultados presentados aquí son de los experimentos estándar de rotación GFS y demostrar una distancia de 96 nm ± 5 nm, [Figura 2], que está de acuerdo en estrecha colaboración con las mediciones de la MF30 (que se une a la N-terminal de la miosina subfragmento-2) y MF20 (que se une en el meromiosina luz) de distancia de separación de anticuerpos en la miosina deduce de los valores de la literatura [Figura 3].

Figura 1. GFS configuración. Las partes principales de GFS están etiquetados.

Figura 2. Esquema de principio de EFP. El lado izquierdo muestra centroide del cordón móvil a una distancia mínima de centro de gravedad de cordón anclado. Como EFP se gira, móviles de cuentas se alinea con vector de la gravedad que también está en paralelo con el eje de la molécula atados. En esta posición, la distancia entre los centroides de las cuentas móviles y anclada es máxima. Arriba a la derecha muestra una parte representativa de una película de GFS. Abajo a la derecha es una imagen de la rotación GFS sometidos.

La figura 3 muestra resultados Representante _min d a la izquierda del gráfico;. D _max con una separación relativa de 17,78 micras, y un retorno a la _vitamina D en torno a la línea de base de alrededor de 17,75 micras de separación relativa entre las cuentas.

Figura 4. Representante resultado del experimento de rotación GFS muestra la distancia entre el MF20 y MF30 anticuerpos promedio de 96 nm. Esto representa la duración aproximada de S2.

Figura 5. Miosina II dímero utiliza para mostrar los archivos adjuntos posible para su uso con el sistema de EFP como anticuerpos y / o anexos de actina. Diferentes posibilidades de fijación permite diferentes estrategias de EFP para medir las diferentes regiones, o aplicar fuerza perpendicular o paralelo al dominio de la barra del dímero miosina.

Discusión

Al convertir una película a una representación digital de un umbral, es crucial para la imagen de un umbral para mantener la misma área en cada fotograma de vídeo. Debido a que las cuentas en un par de bolas se mueven independientemente uno del otro, la deriva en las áreas de un umbral también puede causar la distancia relativa entre los centroides de las cuentas a la deriva y introducir un error considerable. El control de la zona del umbral reducido el error de cinco veces en las mediciones de distancia de 26 nm...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Aminopropyltriethoxysilane	Polysciences, Inc.	919-30-2
Acetone	Fisher Scientific	A18P-4
Pyridine	Sigma-Aldrich	110-86-1
Glutaraldehyde	Fisher Scientific	G7776
Glycine	Research Organics	BP381-1
Tris	Sigma-Aldrich	9682T
Sodium azide	Amresco	71289
BSA	Sigma-Aldrich	AMR-0332-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	MSI	E9884
Nitrocellulose	Sigma-Aldrich	60443
N-N Dimethyl Formamide	Extracted from Large New	D4254
Rabbit skeletal myosin II	Zealand White Rabbits (7-8)	NA
MF30 antibody (9-10)	Developmental Studies Hybridoma Bank	MF30
MF20 antibody (6)	Hybridoma Bank	MF20
Lab microscope	Boreal	WW57905M00
Equatorial mount	Celestron	CG-5
Digital video cam	Sony Corporation	XCDV60
Caliper release	Cabelas	IA-415482
Compression spring	Jones Spring Co.	723
Extension spring	Jones Spring Co.	770
ImageJ	National Institutes of Health	NA
Fire-i drivers & application	Unibrain	3.80
Excel	Microsoft	NA