La detección de señalización de Efectos Complejos de aguas abajo de BMP4 uso In situ PLA, un ensayo de la ligadura de proximidad

Resumen

Aquí se muestra cómo utilizar la ligadura de ensayo de proximidad (PLA), con una combinación de anticuerpos para visualizar la proteína morfogenética ósea (BMP) de señalización en células fijadas. Esta técnica nos permitió seguir la acumulación nuclear de endógeno BMP activa de efectos complejos y cuantificar sus niveles en el tiempo en BMP4 estimulación.

Resumen

BMPs son responsables de una amplia gama de efectos sobre el desarrollo y biológicos. Activar los receptores BMP (fosforilar) la Smad1/5/8 efectores, que a su vez, forman un complejo con Smad4 y trasladar al núcleo donde funcionan como factores de transcripción para iniciar BMP efectos específicos intermedios ^1. Tradicionales técnicas de inmunofluorescencia con anticuerpos contra péptidos Smad fosfo-presentan baja sensibilidad de fondo, de altura y ofrecen la cuantificación bruto ya que dependen de la intensidad de la señal de anticuerpos sobre todo si este es fotosensible fluorescentes. Además, fosfo-Smads pueden no estar todos en el complejo con Smad4 y participó en la transcripción activa.

In situ PLA es una tecnología capaz de detectar las interacciones de proteínas con alta especificidad y sensibilidad ^2-4. Esta nueva tecnología de reconocimiento parejas de anticuerpos con la amplificación de ADN de un sustituto de la proteína. Se genera una señal localizada, discreta en forma de manchas de revelar la posición exacta del evento de reconocimiento. El número de señales se pueden contar y en comparación proporciona una medición. Hemos aplicado in situ PLA, utilizando el kit de Duolink, con una combinación de anticuerpos que permite la detección de los efectores de señalización BMP phospho-Smad1/5/8 Smad4 y sólo cuando estos se encuentran en la proximidad, es decir en un complejo, que ocurre sólo con la señalización activación. Esto permitió que por primera vez, la visualización y medición de los endógenos de señalización de BMP con una alta especificidad y sensibilidad en un tiempo experimento en la estimulación BMP4.

Protocolo

1. Revestimiento de las células y el tratamiento con BMP

1. Cultivo de células en Neuro2a GMEM suplementado con FBS al 10%, 1x no aminoácidos esenciales (NEAM), 1x piruvato sódico y 1 de L-glutamina. División de las células con tripsina (0,05%-EDTA) y la placa de 15.000-20.000 células por pocillo en una diapositiva de cámara de 16 también.
   
   Cultura HEK293T o células COS7 en DMEM suplementado con FBS al 10%, 1x L-glutamina y 1 de penicilina / estreptomicina. Esterilizar diapositivas Polysine por inmersión en etanol al 70% y el uso de la pluma Immedge dibujar 1 cm ² pozos. División de las células con tripsina (0,05%-EDTA) y la placa de 20.000 a 25.000 células por pocillo en medio de 50 microlitros.
2. Se incuban las células a 37 ° C en un humidificado 5% incubadora de CO _2.
3. Después de 24 h reemplazar el medio con suero libre GMEM (suplementado con 0,1% de albúmina, 1x NEAM, 1x piruvato sódico y 1 de L-glutamina) para Neuro2a o con DMEM libre de suero (suplementado con L-glutamina y 1 de penicilina / estreptomicina) para HEK293T / COS7 e incubar las células durante 2-3 h. Mantener tres pozos con células bajo condiciones de cultivo normal (es decir, 10% de SFB) para utilizar como controles.
4. Tratar las células con dorsomorphin (inhibidor de la vía BMP, 2 M) o BMP4 (25 ng / ml) durante el tiempo deseado (por ejemplo, durante 10 min-1 h) ^5.

2. Fijación y permeabilización

1. Preparar el fijador, el 4% PFA. Pesar 4 g de PFA para preparar una solución al 4% en 100 ml de PBS. Calentar la solución a 50 ° C hasta que quede claro. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 micras y se almacenan a 4 ° C hasta su uso. Use fijador fresco (no se almacenan por más de 2 días).
2. Aspirar el medio de los pocillos y lavar con 1XPBS. No pipetear las soluciones directamente sobre las células ya que esto puede resultar en el desprendimiento de las células. Antes de ir al siguiente paso, si la cámara de diapositivas se utilizan quitar las cámaras, pero deja el silicio alrededor de los pozos.
3. Añadir 50 l PFA al 4% e incubar durante 10 minutos, a temperatura ambiente, sin agitación.
4. Se lavan las células con PBS durante 3 x 5 minutos en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente.
5. Tratar las células con 0,5% Triton X-100 en PBS durante 10 minutos sin agitación a temperatura ambiente.
6. Lavan las células con el 0,05% de Tween 20 en TBS (TBS-T) de 3 x 5 minutos en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente.

3. Bloqueo de

1. Toque de la TBS-T. Añadir una gota de solución de bloqueo Duolink II (1x) por pocillo.
2. Incubación los portaobjetos en una cámara húmeda precalentada durante 1 hora a 37 ° C.

4. Anticuerpos primarios

1. Mezclar y diluir aP-Smad1/5/8 (policlonal de conejo) a 1:100 y un Smad4 (monoclonal de ratón) a 1:100 en el diluyente de anticuerpos Duolink II (1x). Prepare también aP-Smad1/5/8 y solo uno-Smad4 en las mismas concentraciones que se utiliza para los controles.
2. Elimine la solución de bloqueo de las diapositivas. Retire como una solución mucho más el bloqueo como sea posible, pero tenga cuidado de no dejar que las células seco antes de añadir el anticuerpo. Añadir 40 ml de las soluciones de anticuerpos a los pozos. En un bien agregar diluyente de anticuerpos sólo como un control negativo adicional.

5. PLA sondas

1. Diluir las dos sondas de PLA (Duolink II anti-ratón de menos y Duolink II anti-conejo PLUS) 1:05 en diluyente de anticuerpos.
2. Elimine la solución de anticuerpo primario de las diapositivas. Este lavado 2 veces 5 minutos cada uno con 1x buffer Duolink II Lavado A en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente.
3. Elimine la solución de lavado A partir de las diapositivas y añadir la solución de PLA de la sonda (40 l / pocillo).
   Incubación los portaobjetos en una cámara húmeda precalentada durante 1 hora a 37 ° C.

6. La ligadura

1. El vórtice Duolink II Ligadura de valores (5 veces) y se diluye 1:5 en agua de alta pureza y mezcla. Al calcular el volumen del agua, tener en cuenta el volumen de la ligasa, que se añadirá a una dilución final de 1:40 justo antes de la adición de la mezcla de los pozos.
2. Elimine la solución de la sonda PLA de las diapositivas. Lavar los portaobjetos en el tampón de lavado 1 x 2 veces por 5 minutos cada uno en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente.
3. Saque la ligasa del congelador con un bloque de congelación (-20 ° C). Añadir la ligasa a la solución de ligación (preparado en el punto 6.1) a una dilución 1:40 y agitar.
4. Elimine la solución de lavado A partir de las diapositivas y añadir la solución de ligación-ligasa a cada pocillo (40 l / pocillo). Incubación los portaobjetos en una cámara húmeda precalentada durante 30 minutos a 37 ° C.

7. Amplificación

Nota: La luz reactivos sensibles. Mantenga las diapositivas de la luz.

1. Diluir el stock Duolink II de amplificación (5 veces) 1:5 en agua de alta pureza y mezcla. Al calcular el volumen del agua en cuenta el volumen de la polimerasa, que se añadirá a una dilución final de 1:80 justo antes de la adición de la mezcla de the pozos.
2. Elimine la solución de ligación-ligasa de las diapositivas. Lavar los portaobjetos en tampón de lavado 1X con una de 2 por 2 minutos cada uno en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente.
3. Saque la polimerasa del congelador con un bloque de congelación (-20 ° C). Añadir la polimerasa para la solución de amplificación (preparado en 7.1) a una dilución 1:80 y agitar.
4. Elimine la solución de lavado A partir de las diapositivas y añadir la solución de amplificación de la polimerasa a cada pocillo (40 l / pocillo). Incubación los portaobjetos en una cámara húmeda precalentada a 100 minutos a 37 ° C.

8. Preparación para la imagen

Nota: La luz reactivos sensibles. Mantenga las diapositivas de la luz.

1. Elimine la solución de amplificación de la polimerasa a partir de las diapositivas y de lavado de 2 veces 10 minutos cada uno en 1x Wash Buffer Duolink II B en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente.
2. Sumergir los portaobjetos en el tampón de lavado de 0,1 x B.
3. Quitar la silicona de la diapositiva 16, así por completo. Añadir ~ 40μl de la II Duolink medio de montaje con DAPI en el cubreobjetos y suavemente a cabo sobre las muestras presionando ligeramente para que no queden burbujas de aire bajo el cubreobjetos. Fijar y sellar el cubreobjetos sobre el portaobjetos con esmalte de uñas. Espere por lo menos 15 minutos antes de proceder a la imagen.
4. Analizar las muestras con un microscopio confocal o de fluorescencia. La obtención de imágenes digitales.

9. Cuantificación

Nota: La luz reactivos sensibles. Mantenga las diapositivas de la luz.

1. Use Duolink ImageTool contar las señales en las imágenes para obtener una medida del nivel de señalización.
2. Comparar las mediciones y realizar un gráfico.

10. Resultados representante

El resultado de un experimento in situ PLA muestra manchas fluorescentes como discretos. La ubicación de la señal depende de las proteínas específicas de estudio.

Figura 1. In situ del EPL en las células después de la estimulación Neuro2a BMP4. Las células fueron tratadas con M dorsomorphin 2 (inhibidor de la vía BMP) (A) o 25 BMP4 ng / ml (B) durante 60 minutos o se deja sin tratar (CE). Los anticuerpos contra P-Smad1/5/8 Smad4 y se utiliza para detectar los complejos activos en A y B. Los anticuerpos primarios aP-Smad1/5/8 solo (C) y un Smad4 solo (D) o la omisión de la primaria anticuerpos (E) se utilizaron como controles. Azul: DAPI; Rojo: señal de PLA. Imágenes fueron obtenidas con un microscopio Leica SP5 confocal.

(F) Las señales de PLA se contó con el software Duolink ImageTool y el número promedio de puntos en el núcleo de cada célula se presenta en el gráfico. (G), las células Neuro2a se deja sin tratar o tratados con Dorsomorphin (2 mM) o BMP4 (25 ng / ml) durante 60 min. Se usaron las células y las proteínas fueron sometidas a SDS-PAGE y se analizaron por inmunotransferencia con aP-Smad1/5/8 y PCNA como control de carga. (*) No específica de banda. Tenga en cuenta que el anticuerpo aP-Smad1/5/8 no puede distinguir entre los tres diferentes proteínas presentes en el complejo con Smad4.

Discusión

La visualización de los complejos de proteínas in situ está en gran demanda, sobre todo para los estudios en donde la interacción de proteínas de señalización y modificación de proteínas son los medios que las células usan para enviar una señal de su superficie al núcleo. No ha sido posible visualizar y cuantificar los complejos entre dos proteínas endógenas in situ con inmunofluorescencia antes. Co-localización de anticuerpos muestra de baja resolución y no se puede utilizar para visualizar una verdadera interacción. PLA es una nueva técnica que los investigadores han empezado a utilizar en diferentes sistemas con gran éxito ^{6, 7.} En este sentido, se muestra cómo utilizar PLA no sólo para visualizar, sino también cuantificar los complejos endógenos entre efectores Smad activado aguas abajo de la estimulación BMP con el tiempo. Hemos utilizado diferentes células de cultivo de tejidos incluyendo Neuro2a y se basó en anticuerpos comerciales planteadas en las diferentes especies (ratón y conejo-Smad4 aP-Smad1/5/8) para lograr esto (fig 1). Este método nos permitió, por primera vez, para ver la activación de los efectores BMP-complejos con el tiempo y no sólo la presencia de la fosforilado Smad1/5/8, que no todos pueden participar en complejos activos con Smad4. Contamos con las señales (Fig. 1F) y se comparó la medida con la cuantificación obtenidos de inmunoblot de las mismas células ⁸ (Figura 1G). Llegamos a la conclusión de que el número de puntos de proporcionar una medición precisa comparativo de los niveles de señalización a través del tiempo. La técnica se aplicó también en otras líneas celulares (HEK293T y COS7) con resultados similares (datos no mostrados).

El principio de la tecnología se basa en dos sondas únicos incluidos en el kit Duolink. Cada sonda PLA consiste en un anticuerpo secundario unido a un oligonucleótido sintético único, que actúa como un periodista. La proximidad de las sondas permite la ligadura de ADN en el lugar exacto donde estas sondas se unen en la proximidad. La distancia de los oligonucleótidos, que permite la hibridación de ADN y la ligadura es pequeño (40 nm <) y por lo tanto, sólo las proteínas que interactúan puede permitir que la ligadura. El ADN ligado entonces puede ser amplificado y detectado con la hibridación de los oligonucleótidos etiqueta de la secuencia amplificada. La amplificación es específica, ya que depende de los principios de hibridación ADN-ADN y también proporciona una alta sensibilidad como el ADN ligado se amplifica varias veces que resulta en la mejora de la ligadura de evento inicial. El ADN amplificado se detecta por hibridación con oligonucleótidos marcados y produce un lugar visible y bastante grandes. Medida que los puntos se puede contar, la señal de PLA no sólo proporciona la información exacta espaciales (la ubicación de los eventos de interacción), sino también una manera objetiva de cuantificar estos eventos ^4.2.

Otras técnicas que se emplean para la detección de interacciones de proteínas incluyen co-inmunoprecipitación, inmunofluorescencia y la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET). Co-immunoprecipitation ensayos son ampliamente utilizados que permite el aislamiento de los complejos de proteínas. El método se acompaña de inmunotransferencia lo que significa que las proteínas se expresan en niveles relativamente altos a fin de detectar. Los problemas de fondo de alta o de la unión no específica de algunas proteínas de los granos son a veces difíciles de superar en co-inmunoprecipitación. Además, co-immunoprecipitation ensayos permiten la detección de proteínas que pueden formar parte de un complejo de proteínas, pero no pueden distinguir aquellos que están en una proximidad muy cercana interactuar físicamente con los demás. Además, co-inmunoprecipitaciones no puede proporcionar la cuantificación en la resolución de celda o de información sobre la localización de los complejos de proteínas en la célula. La detección de co-existencia de complejos de proteínas en una célula o un compartimento de células por inmunofluorescencia se basa en la superposición de las señales de difusión y por lo tanto, tiene una resolución espacial baja y no puede proporcionar información precisa sobre las interacciones de las proteínas. La cuantificación de la señal de inmunofluorescencia se puede hacer por estimación visual sólo si la diferencia es de varias veces, y no puede ser exacta o medibles como las manchas de PLA. FRET permite la visualización de los complejos de proteínas en células vivas y evita la necesidad de anticuerpos y la exposición del epítopo. Sin embargo, FRET lo general depende de la sobreexpresión de proteínas de fusión artificial, lo cual no refleja los complejos de proteínas endógenas como en el PLA.

Condiciones de bloqueo en el protocolo de PLA son fundamentales como la agregación de anticuerpos puede ocurrir y aumentar el fondo. Distintas condiciones de bloqueo se puede encontrar en las fichas técnicas de anticuerpos. Los controles adecuados con omisión del anticuerpo primario y secundario proporcionan información sobre lo que pudo haber salido mal y que necesitan estar siempre incluido. Es importante a la pantalla de anticuerpos diferentes que le dará al menos de fondo cuando se emplean solos y la mejor señal cuando están juntos. La fijación de cells es crítico ya que más de la fijación puede causar complejos de proteínas para desnaturalizar completamente y se degradan, mientras que la fijación insuficiente puede conducir a la pérdida de complejos de proteínas durante las etapas del procedimiento. Esto puede ser controlado mediante la reducción de la concentración del fijador al 3% o al limitar el tiempo de fijación. Sin embargo, la fijación depende también de si los anticuerpos primarios reconocer proteínas desnaturalizadas o no. A medida que la técnica de PLA es muy sensible, requiere de cuidados especiales para mantener los tiempos de incubación y las condiciones micro iguales entre las diferentes muestras.

Las muestras no deben dejarse secar, en cualquier caso antes de la etapa final. Secado de las muestras puede dar lugar a un aumento de fondo. La remoción completa de la solución de bloqueo también es fundamental para evitar el fondo. Los tampones de lavado debe estar siempre a temperatura ambiente antes de su uso, como la temperatura baja retarda las reacciones enzimáticas. Para la solución de problemas, consulte el manual del kit.

Es útil el uso de las manchas para determinar la localización subcelular de la señal de PLA (por ejemplo, DAPI, la actina, etc.) Aquí hemos utilizado DAPI (en el medio de montaje) para teñir los núcleos. PLA es compatible con el uso de inmunofluorescencia con anticuerpos para determinar el tipo de células o compartimento celular (no mostrado aquí). Cuantificación exacta se puede hacer contando las señales y el uso de software específico (Herramienta Duolink imagen, Olink Biosience).

En conclusión, hemos demostrado cómo utilizar in situ PLA, utilizando el kit de Duolink para detectar la señalización de BMP en células fijadas y presentó sus ventajas: fácil de usar, altamente sensible, no de fondo, y una capacidad única para cuantificar los activos de señalización de BMP en el lugar.

La limitación de la aplicación de esta técnica para estudiar las interacciones de diferentes proteínas depende de la disponibilidad y la calidad de los anticuerpos primarios que reconocen las proteínas objeto de la investigación.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
GMEM	Invitrogen	21710025
DMEM	Invitrogen	21063029
FBS	AutogenBioclear	7.01
Non-essential Amino Acids	Invitrogen	11149068
Sodium Pyruvate	Invitrogen	11360070
Penicillin / Streptomycin	Invitrogen	15140122
L-glutamine	Invitrogen	25030-054
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid	Invitrogen	25300-054
16-well chamber slides	Lab-Tek	178599
Polysine	VWR international	631-0107
Cover glass	VWR international	631-0138
a-pSmad1/5/8	Cell Signaling Technology	9511
a-Smad4 (B8)	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-7966
Dorsomorphin	Merck & Co., Inc.	171260-10MG
Recombinant Mouse BMP-4	R&D Systems	5020-BP-010
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Promega Corp.	H5151
Duolink II Detection Reagents (Orange)	Olink Bioscience	92007-0100
Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS	Olink Bioscience	92004-0100
Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS	Olink Bioscience	92002-0100
Duolink II Mounting Medium with DAPI	Olink Bioscience	82040-0005
Duolink II Wash Buffers Fluorescence	Olink Bioscience	82049