La cartografía y la aplicación de potenciador de la trampa de expresión Flippase en larvas y adultos Drosophila SNC

Resumen

Se describe un Flippase inducida intersectorial Gal80/Gal4 represión (FINGR) método, permitiendo al tejido-específica para determinar FLP GAL80 patrones de expresión. Siempre que sea Gal4 y la superposición de FLP, Gal4 expresión es activada (GAL80 un tirón hacia fuera) o desactivar (GAL80 volcó en). El método FINGR es versátil para el análisis clonal y la asignación de circuitos neuronales.

Resumen

El método binario Gal4 / UAS es de gran alcance para el gen y la manipulación de los circuitos neuronales de Drosophila. Para la mayoría de los estudios neurobiológicos, sin embargo, rara vez se Gal4 expresión específica de tejido suficiente para permitir la correlación exacta de los circuitos con indicadores de comportamiento. Para superar este obstáculo, hemos desarrollado recientemente el método FINGR para lograr una más restrictiva Gal4 expresión en el tejido de interés. El método FINGR tiene tres componentes: 1) el sistema GAL4/UAS tradicionales, 2) un conjunto de FLP / FRT mediada GAL80 herramientas de conversión, y 3) potenciador trampa FLP (ET-FLP). Gal4 se utiliza para definir los circuitos neuronales primarias de interés. Comparando los Gal4 UAS con un efector, tal como UAS-MJD78Q o ^ts UAS-Shi, regula la actividad neuronal, que es a su vez, se manifiesta por alteraciones en el comportamiento de las moscas. Con un adicional de UAS-periodista como UAS-GFP, el circuito neural involucrado en la conducta específica puede ser al mismo tiempo asignado para el análisis morfológico. Para Gal4 líneas con amplia expresión, Gal4 expresión puede ser restringida por el uso de dos complementarios GAL80 convertidora de herramientas: bañera ^P> GAL80> ("flip out") y la bañera ^P> detener> GAL80 ("flip en '). Finalmente, los investigadores pueden a su vez GAL80 o desactivar, respectivamente, con la ayuda de tejidos específicos ET-FLP. En el flip-en el modo, GAL80 reprimirá Gal4 expresión siempre que sea Gal4 y ET-FLP se cruzan. En el modo de tapa-out, GAL80 aliviará Gal4 la represión en las células en las que se superponen Gal4 y FLP. Ambos enfoques permiten la restricción del número de células en el circuito de Gal4 definido, pero en un patrón inverso. El método FINGR es compatible con una amplia colección de Gal4 líneas en la comunidad de la mosca y de gran versatilidad para el análisis clonal tradicionales y para la asignación de circuitos neuronales. En este protocolo, se demuestra la correlación de patrones de expresión de FLP de seleccionar ET-FLPx2 líneas y la eficacia del método FINGR en las células fotorreceptoras. El principio del método FINGR también debe ser aplicable a otros organismos modelo genético en el cual GAL4/UAS, GAL80 y FLP / FRT se utilizan.

Protocolo

1. Drosophila cepas

1. Gal4 conductor:
   GMR-Gal4, que expresa Gal4 en las células fotorreceptoras.
2. UAS líneas
   UAS-MJD78Q (o UAS-polyQ), que causa la degeneración neuronal en las células que expresan Gal4.
   UAS-GFP, que expresa GFP en células que expresan Gal4.
3. FLP líneas
   ey-FLP, que expresa FLP en los fotorreceptores y en los subgrupos de regiones del cerebro.
   ET-FLPx2 líneas, que son potenciador trampa de las líneas que contienen dos copias del FLP (FLP-IRES-FLP). Hemos generado ~ 1000 ET-FLP líneas (Bohm et al., 2010), cuyos patrones de expresión aún no se han caracterizado. Aquí se describe la caracterización del patrón de expresión de seleccionar ET-FLPx2 en la mosca de larvas y adultos del sistema nervioso central (SNC).
4. FLP reportero
   yw, la actina ^P> CD2> Gal4, UAS-GFP (Pignoni y Zipursky, 1997), que depende del patrón de expresión de ET-FLPx2 a través de actina ^P> Gal4, UAS-GFP a FLP mediada por recombinación de la escisión> CD2.
5. Dos complementarios GAL80 de conversión de las herramientas
   Bañera ^P> GAL80> (Gordon y Scott, 2009), la construcción plegable, que expresa constitutivamente en todos los tejidos GAL80 impulsado por un promotor de la tubulina fuerte. Al FLP mediada por recombinación,> GAL80 se voltea hacia fuera y GAL80 expresión termina sólo en ET-FLPx2 que expresan los tejidos.
   Bañera ^P> detener> GAL80 (Bohm et al., 2010), el flip-en construcción, que no expresa GAL80 en condiciones normales. GAL80 expresión es activada por el promotor de la tubulina sólo en ET-FLPx2 que expresan los tejidos en los que se da vuelta FLP parar> y gira en GAL80.
6. Las moscas para las pruebas de la actividad FLP en el ojo compuesto
   GMR-Gal4, UAS-polyQ, bañera ^P> detener> GAL80 (Bohm et al, 2010.), Que ha degenerado y los ojos sin pigmento. En FLP-que expresan las células fotorreceptoras, la expresión polyQ se apaga después de GAL80 flip-en.
   GMR-Gal4, UAS-polyQ; (. Bohm et al, 2010) bañera ^P> GAL80>, que tiene los ojos normales. En FLP-que expresan las células fotorreceptoras, la expresión polyQ se activa después de GAL80 plegable.

2. Reactivos

Tampón fosfato salino (PBS, 1X), pH 7,4.
4% de paraformaldehído (PFA), diluido en PBS a partir de 16% de PFA, EM de grado (Cat # 15710, Ciencias de la microscopía electrónica, Hatfield, PA)
PBT, 1XPBS contiene 0,1% de Triton X-100 (Sigma)
Anti-Elav (MAB, 9F8A9; hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco, de la Universidad de Iowa), las manchas de todas las neuronas de Drosophila.
Anti-Repo (MAB 8D12; Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma de la Universidad de Iowa) tiñe las células gliales en Drosophila.
Alexa 594 pollos contra anticuerpo secundario del ratón (Invitrogen)

3. Mapeo de los patrones de expresión de potenciador trampa líneas FLPx2 (* pasos críticos)

1. Recoge las hembras vírgenes de la yw, la actina ^P> CD2> Gal4; línea UAS-GFP y cruz para los machos de cada uno de ET-FLPx2 líneas. El primero sirve como un reportero GFP para la expresión del tejido de la ET-FLP.
2. * Disección de vagar 3 _º estadio las larvas de F1, mantener el sistema nervioso central (es decir, el cerebro y el cordón nervioso ventral, VNC) y la pared del cuerpo, fijar durante 1 hora en PFA al 4% en el hielo, lavar 3 veces con helado de PBS, seguido de se lava 3 veces con PBT.
   Disección
   1. Quitar vagando 3 ^º estadio las larvas de F1 y colocarlos en un recipiente limpio plato Sylgard (35 mm x 10 mm placa de Petri llenas de 2 gramos de Sylgard - mezclado de acuerdo a las instrucciones de fabricación).
      1. Eliminar los restos de comida con pincel
   2. Llenar el plato con helado de 1XPBS y el lugar en el hielo para anestesiar a las larvas
   3. Sujete los ganchos de la boca de una larva con un par de pinzas y agarre la cutícula se extiende cerca del espiráculo anterior con otro par de pinzas y la cáscara de la cutícula hacia el extremo posterior. El CNS se adjuntará a la boca a lo largo de los ganchos con las glándulas salivales, intestino, y los discos imaginal.
   4. Retire el exceso de tejido y discos imaginales que rodean el sistema nervioso central.
   5. Transferir el sistema nervioso central en una PBS-3 y plato lleno de pyrex.
      1. A siliconado P200 punta de la pipeta se puede utilizar para evitar que se seque el tejido.
   6. Fix durante 1 hora en 200 l de PFA al 4% en el hielo.
      1. Asegúrese de que el SNC está completamente sumergida en la PFA.
         1. Si el sistema nervioso central flota, esto normalmente indica que el sistema nervioso central no se limpia adecuadamente en el tejido circundante.
   7. Lave 3 veces con helado de PBS seguido de lavados 3 veces con PBT.
3. * Disección del sistema nervioso central de las moscas adultas F1.
   1. Anestesiar a las moscas con CO ₂ o el lugar de las moscas contenido dentro de un frasco vacío en hielo durante 10 minutos.
   2. Adultos a cabo las moscas en un recipiente de vidrio un 95% EtOH llena de hielo durante 30 segundos.
   3. Transferencia de las moscas adultas en un recipiente de vidrio lleno de 1XPBS en el hielo.
      1. Lave 3 veces con helado de 1X PBS para eliminar EtOH residual
   4. Coloque una mosca en un Sylga 35 mmº plato lleno con helado de PBS 1X
   5. Coloque el lado ventral hacia arriba e inserte un lápiz pequeño insecto (pins minutiens 0,1 mm) a mitad del abdomen.
      1. Con un par de pinzas de mantener la base de las piernas y eliminar las piernas con otro par de pinzas.
   6. Eliminar la cutícula cabeza
      1. Mientras que agarrar la trompa con un par de pinzas, coloque otra debajo del ojo y la piel de la cutícula hacia la línea media dorsal de la cabeza de mosca.
      2. Coge el otro ojo y eliminar la cutícula que queda en el otro lado.
      3. El uso de pinzas afiladas y / o una aguja de tungsteno afilado, retirar el tejido traqueal que rodean el cerebro
         1. La limpieza inadecuada de la tráquea se traducirá en una fuerte auto-fluorescencia, obstruyendo la expresión de GFP, y permiten que el cerebro flotando en la fijación de
   7. VNC Disección
      1. Eliminar la cutícula dorsal
         1. Comenzando en el extremo posterior del tórax, colocar dos pinzas en cada lado de la preepisternum 3 ^º (es decir, tomando la base de las patas traseras).
         2. Separe cuidadosamente la cutícula de distancia de la línea de la línea media ventral, repita este hasta llegar a la base del cuello.
         3. Suavemente separa las dos mitades de la cutícula dorsal exponiendo el VNC
      2. A continuación, retire el abdomen del tórax. Mientras que con un par de pinzas para sostener el tórax en la base segunda etapa, el uso de otro par de pinzas para agarrar el abdomen, cerca del esternito abdominal primero y tire el abdomen fuera.
      3. Para quitar el VNC del tejido circundante torácica. Mantenga el área del húmero con un par de pinzas y con otro par de pinzas suaves lágrimas de distancia de la mayoría de la canal torácico.
      4. En este punto no debe ser un anillo de tejido conectivo que rodea a la conectivo cervical (cuello). El uso de dos pinzas de romper el anillo de distancia.
      5. Elimine cualquier exceso de tejido que rodea el tórax VNC
   8. Transferir el cerebro y VNC a 9-así plato Pyrex contiene 1X PBS sobre hielo
      1. A siliconado P200 punta de la pipeta se puede utilizar para evitar que se seque el tejido
4. * Fijar el sistema nervioso central adulto durante 1 hora en PFA al 4% en el hielo y lavar 3 veces con PBS helado y 3 veces con PBT.
5. Incubar la preparación del SNC adulto o el sistema nervioso central y la pared del cuerpo de las larvas a 4 ° C durante la noche con anticuerpos frente a cualquiera de las neuronas (anti-Elav, 1:10) o glía (anti-Repo. 1:10). Lavar la preparación 5X con PBT.
6. Incubar con la preparación de adultos o larvas con Alexa 594 pollos contra anticuerpos secundario del ratón (1:100) a temperatura ambiente durante 2 horas, y lavar la preparación con PBS.
7. Montar el sistema nervioso central larvas o adultos en una diapositiva. Para preservar la forma natural del sistema nervioso central, use un anillo de plástico en forma de O (Etiqueta de refuerzo claro, Avery Dennison, Productos de oficina, Brea, CA) en la diapositiva como un puente de mini a suspender la hoja de la cubierta.
8. Examine la preparación de los patrones de expresión GFP y Elav (o fuera de subasta) bajo un microscopio de fluorescencia.

4. La aplicación de dos complementarios GAL80 de conversión de las herramientas de la represión Gal4 en los fotorreceptores

1. Voltear GAL80 cabo a través de bañera ^P> GAL80> (Figura 5).
   1. Recoge los hombres de la GMR-Gal4, UAS-polyQ, bañera ^P> GAL80 línea>. Tenga en cuenta que los ojos compuestos son normales en estas moscas.
   2. Mate con vírgenes FLP-ey.
   3. Recoger las moscas F1 y examinar el fenotipo del ojo.
2. Mover de un tirón a través de GAL80 en bañera ^P> detener> GAL80 (Figura 5).
   1. Recoger GMR-Gal4, UAS-polyQ, bañera ^P> detener> GAL80 moscas macho y examinar el fenotipo del ojo. Tenga en cuenta los degenerados y los ojos sin pigmento en estas moscas en comparación con las cepas de tipo salvaje (Cantón-S)
   2. Mate con vírgenes FLP-ey;
   3. Recoger las moscas F1 y examinar el fenotipo del ojo.
3. Seleccione ET-FLPx2 líneas de expresión en las células fotorreceptoras

Pasos 4.1 y 4.2 se puede repetir con ET-FLPx2 líneas que expresan FLP en un subconjunto de las células fotorreceptoras. Por otra parte, ya sea el GMR-Gal4, UAS-polyQ, bañera ^P> detener> GAL80 moscas o el GMR-Gal4, UAS-polyQ, bañera ^P> GAL80> moscas se puede cruzar a la persona ET-FLPx2 líneas para la detección de las líneas que expresan FLP en las células fotorreceptoras. Valiosa ET-FLPx2 líneas son las que expresan sólo en un subgrupo de FLP o de un solo fotorreceptor (Figura 6).

5. Los resultados representativos

El patrón de expresión de un determinado ET-FLPx2 línea puede ser fácilmente examinados y documentados en la F1 larvas o moscas adultas derivadas de la cruza entre yw, la actina ^P> CD2> Gal4, UAS-GFP vírgenes y ET-FLPx2 los hombres (Figura 1) . Por lo general, de tres a cinco réplicas de los animales F1, se disecan y se examina para determinar la reproducibilidad del patrón de expresión de FLP (Bohm et al., 2010). La figura 2 muestra el patrón de expresión de FLP en ET-173A FLPx2 línea en el SNC de larvas y adultos. El patrón de FLP pueden ser analizados usando un marcador neuronal o glial (Figura 3 y 4).

Los resultados mostrados en la Figura 7 ilustran la eficacia de los flip-GAL80 y flip-sistemas de producción en la represión intersectorial de Gal4 siguientes FLP mediada por recombinación. La bañera ^P> detener> GAL80 construcción no parece haber ninguna fuga de expresión GAL80 (sobre la base de la degeneración uniforme y despigmentación de los fotorreceptores), y sin embargo es 100% efectiva para mover de un tirón en GAL80 con la ayuda de eyFLP para reprimir GMR- Gal4 y restaurar la vista a la apariencia normal (Fig. 7A). Por el contrario, bañera ^P> GAL80> completamente reprime GMR-Gal4 antes de la introducción de eyFLP. Después de GAL80 plegable, GMR-Gal4 unidades UAS-polyQ expresión, lo que lleva a degenerar y los ojos sin pigmento (Fig. 7B). En este ejemplo, usamos un pan-FLP photorecetor al mapa 'circuitos' el fotorreceptor pero no examinó las consecuencias del comportamiento. Utilizando enfoques similares con comportamiento relevante Gal4 líneas, trazamos parte de la CCAP-Gal4 circuito de regulación de la expansión del ala de las moscas adultas (Bohm et al., 2010). Creemos que el método FINGR será muy útil para ayudar a nuestra comprensión de las bases neuronales del comportamiento.

Figura 1. . Examinar el patrón de expresión de una ET-line FLPx2 El patrón de expresión de FLP (óvalos azules) de una línea de ET-FLPx2 puede ser determinada por el cruce de una ET-FLPx2 masculino (arriba a la izquierda) con una actina ^P> CD2> Gal4, UAS- GFP virgen (superior derecha). Omnipresente actina ^P> Gal4 expresión en la mujer se ve obstaculizado por los padres de la inserción de la FRT (triángulos de color gris), flanqueada secuencia CD2. En la descendencia F1, FLP especial la secuencia CD2, lo que permite actina ^P> Gal4 para conducir UAS-GFP expresión.

Figura 2. Patrón de expresión de una línea de ET-FLPx2 en larvas y adultos del sistema nervioso central. Estas imágenes muestran el sistema nervioso central (cerebro y nervios ventral, VNC) disecados de la descendencia producida a partir de apareamiento yw, la actina ^P> CD2> Gal4, UAS-GFP a los padres a la ET-173A FLPx2 línea. Por recombinación de los> CD2 casete>, FLP activa actina ^P> GAL4 expresión (la expresión consecuente de la UAS-GFP). Por lo tanto, el patrón de las buenas prácticas agrarias informes FLP-que expresan las células. El panel A muestra el patrón de expresión de FLP larvas, mientras que el panel B muestra el patrón de expresión para adultos en línea 173A.

Figura 3. Caracterización de los tipos de células que expresan flippase en ET-FLPx2 línea # 688A. A, Una imagen compuesta de un fijo F1 larva 3 ^º estadio teñidas con anti-REPO de un cruce entre ET-FLPx2 línea # 688A y una línea de GFP Flippase presentación de informes. BD, un gran aumento (Zeiss Plan-Apochromat 63x aceite) vista tomada desde el extremo posterior de un VNC desde las larvas ³ de estadio.

Figura 4. Caracterización de los tipos de células dentro del cuerpo de hongo de la ET-FLPx2 línea # 150. AC, una imagen de gran aumento (63x de inmersión en aceite) del cuerpo de setas en un fijo larva F1 3er estadio teñidas con anti-REPO.

Figura 5. Ilustración de la GAL80 Estrategias Flip-y Despliegue. A. En la estrategia plegable, tubulina promotor impulsado GAL80 (Tina ^P> GAL80>) es constitutivamente activa, lo que resulta en la represión de GMR-Gal4 y un fenotipo de ojo de tipo salvaje (ojos rojos). Esta represión se elimina mediante la introducción de FLP (morado), que le dará la vuelta GAL80 a cabo (en el centro, rojo) y permite GMR-Gal4 para conducir UAS-polyQ expresión. Esto se traduce en la degeneración de las células fotorreceptoras (ilustrado por los puntos blancos en el ojo). B. En el recíproco de la estrategia anterior, la tubulina promotor impulsado GAL80 expresión se ve interrumpida por FRT (gris triángulo) flanqueado "stop" codón. En ausencia de GAL80, GMR-Gal4 se une a UAS-polyQ causando la degeneración neuronal en los fotorreceptores (ilustrado por los puntos blancos en el ojo). Al cruzar el GMR-Gal4, UAS-polyQ, bañera ^P> detener> GAL80 machos con hembras vírgenes que expresan FLP en las células fotorreceptoras, FLP (púrpura) se catalizan la recombinación en los sitios FRT, extirpando el "stop" codón (en el centro, rojo), lo que permite GAL80 expresión y la represión de la GMR-GAL4. Esta reserva la neurodegeneración en las células fotorreceptoras (ilustrado por la falta de wHite puntos en el ojo).

Figura 6. La aplicación del método FINGR en mover de un tirón GAL80 a cabo con ET-FLPx2 línea # 688A progenie F1 de un cruce entre ET-FLPx2 línea # 688A virgen de GMR-Gal4, UAS-polyQ;. TubP> GAL80 masculino. La falta de pigmento en el medio de la omatidios ojo representa la expresión de FLP en la línea # 688A. En esta zona GAL80 supresión de GMR-Gal4 fue relevado permitiendo que el Gal4 para conducir UAS-polyQ.

Figura 7. La aplicación del método FINGR en mover de un tirón GAL80 dentro o fuera de Gal4 cruzan en los fotorreceptores. A. La bañera ^P> detener> GAL80 flip-en el sistema restringe GAL4 expresión en una forma dependiente de FLP. En GMR-Gal4, UAS-polyQ, bañera ^P> detener> GAL80 moscas, las células fotorreceptoras se degeneran y despigmentadas (mosca de la izquierda). Tras la introducción de eyFLP, GAL80 se expresa en las células fotorreceptoras, que resulta en la represión total de GMR-Gal4, que a su vez se apaga el polyQ expresión y produce moscas con ojos normales (mosca de la derecha). B. La bañera ^P> GAL80> tirón Salida sistema funciona de la manera opuesta a la bañera ^P> detener> GAL80 flip-en el sistema. Bañera ^P> GAL80> constitutivamente GAL4 reprime y reprime la expresión de polyQ (izquierda volar, con los ojos normales). Tras la introducción de eyFLP, GAL80 se voltea hacia fuera de las células fotorreceptoras, el alivio de la supresión de la GMR-Gal4 y encender la polyQ expresión. Esto lleva a las moscas con ojos de degenerado y despigmentadas (mosca de la derecha).

Discusión

El sistema GAL4/UAS ha sido ampliamente utilizado con éxito y por Drosophilists de varios estudios biológicos (Marca y Perrimon, 1993; Duffy, 2002). Hasta la fecha, la comunidad de la mosca ha generado miles de promotor impulsado y potenciador de las líneas Gal4 trampa. Una de las principales del método FINGR es que es compatible con el sistema GAL4/UAS, lo que permite ampliar significativamente el poder de Gal4 en los estudios de Drosophila.

Una aplicación importante del método es FINGR a los circuitos neurales que subyacen a ajustar la conducta a través Gal4/Gal80 intersección. Estos comportamientos pueden incluir, pero no se limitan a, el aprendizaje y la memoria, el cortejo, el sueño y el ritmo circadiano. El método FINGR también puede ser utilizado para asignar las neuronas críticos que son propensos a la neurodegeneración en la modelización de enfermedades neurodegenerativas humanas como el Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y las enfermedades de Parkinson. Del mismo modo, los focos de las neuronas o circuitos neuronales esenciales para la cocaína de mediación, el alcohol y la adicción a otras sustancias pueden ser asignadas mediante el método FINGR. Cabe señalar que Gal4s condicional (Osterwalder et al, 2001;.. Romana et al, 2001) podría ser utilizado con el método FINGR con el fin de obtener el control temporal de los circuitos neuronales y sus comportamientos. Modificación de la GAL80 convertidora de herramientas mediante un GAL80 sensibles a la temperatura ^(ts GAL80, McGuire et al., 2003) puede producir bañera ^P> detener> GAL80 ^ts o bañera ^P> GAL80 ^ts>, añadiendo flexibilidad adicional temporal en la manipulación del circuito. Más allá del sistema nervioso, el método FINGR es igualmente aplicable a la restricción de Gal4 expresión en los subconjuntos de células ya sea el ala o la pierna.

Las líneas de ET-FLPx2 será un recurso valioso para todos los biólogos interesados ​​en Drosophila FRT / FLP basado en el análisis clonal (Xu y Rubin, 1993), incluyendo MARCM (Lee y Luo, 1999). También se espera que algunas ET-FLPx2 líneas pueden reemplazar choque térmico-FLP para la producción de clones y reproducible para repetir los análisis morfológicos y de comportamiento. Como potenciador de la trampa Gal4 líneas, la mayoría de ET-FLPx2 líneas es probable que se expresa específicamente en las células de su interés. La mayoría de las líneas se expresa FLP en las células de interés y en otras células o tejidos así. Sin embargo, la falta de "la especificidad tisular de ambas Gal4 y ET FLPx2-no será una preocupación importante para el método de FINGR mientras su región de superposición es deseable para un experimento particular. FINGR está diseñado para convertir dos 'grandes' sistemas en una refinada.

Los métodos se muestra en estos protocolos son bastante estándar y deben ser reproducibles. Los principales pasos de advertencia que requieren atención de uno son la selección y el uso del fijador. Otros fijadores de PFA se debe evitar debido a que se apague la señal de las buenas prácticas agrarias. También hemos observado que el plato de la disección no debe ser utilizado para la fijación de PFA para evitar la posibilidad de que la expresión de FLP no se de buena tinta por las buenas prácticas agrarias.