Evaluación cuantitativa de las células inmunes en el tejido de la médula espinal lesionada por citometría de flujo: un nuevo uso de un método de purificación celular

Resumen

La cuantificación de la inflamación celular en el SNC lesionado / patológica por citometría de flujo se ve complicada por los residuos de lípidos / mielina que puede tener un tamaño similar y la granulación de las células, disminuyendo la sensibilidad / precisión. Hemos avanzado un método de preparación de células para eliminar los restos de mielina y mejorar la detección de células por citometría de flujo en la médula espinal lesionada.

Resumen

La detección de las células inmunes en los heridos sistema nervioso central (SNC) mediante técnicas morfológicas o histológico no siempre ha proporcionado verdadero análisis cuantitativo de la inflamación celular. La citometría de flujo es un método rápido alternativo para cuantificar las células inmunes en el cerebro lesionado o tejido de la médula espinal. Históricamente, la citometría de flujo se ha utilizado para cuantificar las células inmunes de la sangre recogida o el bazo o el timo disociada, y sólo unos pocos estudios han intentado cuantificar las células inmunes de la médula espinal lesionada por citometría de flujo utilizando tejido fresco cable disociados. Sin embargo, el tejido disociado de la médula espinal se concentra con restos de mielina que pueden confundirse con las células y reducir la fiabilidad de recuento de células obtenidas por el citómetro de flujo. Hemos avanzado un método de preparación de células con el sistema de gradiente OptiPrep que haga efectiva la separación de lípidos / mielina restos de las células, proporcionando cuantificaciones sensible y fiable de la inflamación celular en la médula espinal lesionada por citometría de flujo. Como se describe en nuestro estudio reciente (Beck & Nguyen et al, Brain 2010 Feb; 133 (Pt 2):.. 433-47), la preparación de células OptiPrep había aumentado la sensibilidad para detectar la inflamación celular en la médula espinal lesionada, con un recuento de tipos específicos de células se correlaciona con la gravedad de la lesión. Fundamentalmente, el uso novedoso de este método proporcionó la primera caracterización de la inflamación celular agudo y crónico después de la lesión para incluir un curso a tiempo completo para los leucocitos polimorfonucleares (PMN, neutrófilos), los macrófagos / microglia y las células T en un período de entre 2 horas 180 días después de la lesión (ppp), la identificación de una fase de novela sorprendente segundo de la inflamación celular. Caracterización completa de la inflamación celular con este método puede proporcionar una mejor comprensión de la neuroinflamación en el SNC lesionado, y revelan un componente importante de la neuroinflamación multifásico que pueden ser críticos para el diseño e implementación de estrategias racionales de tratamiento terapéutico, tanto a base de células y farmacológicos intervenciones para el DME.

Protocolo

1. La disociación de tejido de la médula espinal

1. Segmentos de la médula espinal T8-T10 de no lesionados o de la médula espinal lesionada contusión (lesión en la T9) ratas Sprague Dawley fueron disecados y disociado mecánicamente con tijeras finas en HBSS a temperatura ambiente, como se describió anteriormente ^1. Antes de la disociación del tejido, toda columnas de la médula espinal se mantuvieron en hielo seco durante 5 minutos antes de la extracción de segmentos de la médula T8-T10.
2. Trozos de tejido fueron recuperados por centrifugación (1 minuto, 1.000 rpm, a temperatura ambiente) y disociadas enzimáticamente con 2,5 mg de tripsina y 5 colagenasa mg en 5 ml de DME (Media Dulbecco modificado de Eagle) durante 20 minutos a 37 ° C antes de la trituración (~ 10 veces a temperatura ambiente) con una pipeta Pasteur de vidrio (9 pulgadas).
3. 10 ml de DME + 10% de suero fetal bovino se añadió a las células para inhibir las actividades enzimáticas y luego se filtró a través de un filtro de 40 micras de células. Después de una vuelta rápida, el pellet de células se resuspendió en 6 ml de HBSS y superpuestos en OptiPrep soluciones gradiente se describe a continuación.

2. La creación de soluciones OptiPrep gradiente

1. Diluido OptiPrep fue construido mediante la dilución de OptiPrep 1:1 con tampón MOPS (0,15 M NaCl, 10 mM MOPS, pH 7,4).
2. Cuatro OptiPrep soluciones gradiente se hace mezclando 350, 250, 200, o 150 l OptiPrep diluido con HBSS a un volumen final de 1 ml (Tabla 1).
3. Las cuatro soluciones fueron lenta y cuidadosamente colocados en capas en un tubo cónico de 15 ml con la menor diluir en la parte inferior y la más diluida en la parte superior (Figura 1).

3. La separación de lípidos / mielina desechos de las células

1. 6 ml de disociar las células de la columna vertebral en HBSS fue cuidadosamente por capas en la parte superior de las soluciones de gradiente OptiPrep.
2. Tubo que contiene las células y las soluciones de gradiente se centrifugó (15 min, 1900 rpm o 726 RCF, de 20 ° C) con una centrífuga Eppendorf 5810R con rotor basculante (A-4-62), la separación de la solución de células en distintas capas de lípidos / restos de mielina (parte superior del tubo de 7 ml), seguido por tres capas de neuronas, de células inflamatorias, células gliales y las células rojas de la sangre en el sedimento. Aunque la mayoría de las células inflamatorias, como monocitos, macrófagos, granulocitos polimorfonucleares y los linfocitos se encuentran en el sedimento, algunos de gran tamaño, los macrófagos activados pueden encontrarse en capas por encima de la pastilla.
3. La capa de restos de lípidos / mielina (principio 7 ml) se aspira cuidadosamente y se retira. Las células fueron lavadas y resuspendidas en 2,5 ml HBSS y se utiliza para inmunomarcaje a continuación.

4. Inmunomarcaje de células inmunitarias específicas para citometría de flujo

1. Las células (500 l) recogidos de los preparativos de la médula espinal se sedimentaron y se resuspendieron en cloruro de amonio 0,85% (diluido en agua destilada) durante 5 minutos para lisar los glóbulos rojos.
2. Las células se lavaron con 500 l HBSS y luego bloquearon durante 30 minutos en el normal de conejo o suero del ratón a temperatura ambiente.
3. Las células se lavaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con anticuerpos (de conejo anti-PMN FITC, química precisa y científica; ratón anti-rata ED1 Alexa 488, Serotec, o el ratón anti-rata CD3 Alexa 488) o isotipo IgG diluido en solución HBSS (todos a la dilución 1:100), como se describió anteriormente ^1.
4. Las células fueron lavadas dos veces después de cada paso por encima y luego resuspendido en 300 l HBSS después de la etapa final.

5. Evaluación cuantitativa de células por citometría de flujo

1. Las muestras fueron analizadas en un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton-Dickinson), utilizando el software Cell Quest. 5.000 eventos por muestra se lee en todas las muestras y análisis de datos se completó con la Cumbre (DakoCytomation).
2. Puertas de citometría de flujo se ajusta con el control de isotipo IgG células etiquetados o células de médula espinal de los animales de control no lesionados para establecer valores de referencia para la normalización a través de los puntos de tiempo como se describió anteriormente ^1. Los valores medios de las células de forma positiva la etiqueta se expresaron como porcentaje (± SEM) de toda la muestra.

6. Los resultados representativos:

La capacidad de un gradiente de OptiPrep para eliminar los restos de mielina y mejorar la detección de células inmunes por citometría de flujo se evaluó mediante la cuantificación de los PMN espinal en un dpi (fig. 1B), el pico ya se ha informado de la infiltración de PMN después de la lesión ^1-3. Por otra parte, idéntica disecada la médula espinal fueron disociadas enzimáticamente sin OptiPrep-eliminación de restos de mielina y se evaluaron de manera similar en paralelo para la infiltración de PMN por citometría de flujo. Como hemos informado anteriormente ^1, se produjo un cambio en la posición de los acontecimientos en las muestras aisladas con el método de purificación OptiPrep gradiente en comparación con la disociación enzimática solos, lo que demuestra el porcentaje de PMNs detectados en las muestras con restos de mielina intacta fue sólo una fracción (0,5%) del porcentaje de PMNs detectados (5,1%) en OptiPrep Purifmuestras de IED (fig. 1B). Estos datos sugieren que los restos de mielina en las preparaciones de tejidos puede ocultar las lecturas de citometría de flujo, y demostrar que la eliminación de los residuos de mielina aumenta la sensibilidad de la detección de células inmunes en el tejido de la médula espinal lesionada.

Una vez establecida la sensibilidad del sistema de gradiente OptiPrep para la detección de células en la médula espinal lesionada, que caracteriza los cambios en la infiltración celular durante un período que va desde 2 horas a 180 dpi y se estableció una respuesta novedosa multifásico de la inflamación celular después de la lesión que incluyó PMNs, macrófagos / microglia y las células T. Según lo confirmado por los estudios previos ^1-3, los PMN entró por primera vez el cable a las 2 horas después de la lesión y alcanzó un máximo de 1 ppp (Figura 2 y 4). Macrófagos / microglia en el otro lado ^1,4,5, no se detectaron en la médula espinal lesionada hasta el 3 de dpi, y llegó inicialmente a los 7 dpi (Figura 3 y 4). Sorprendentemente, se muestra por primera vez que los macrófagos / microglia alcanzó su punto máximo en el segundo tiempo de 60 dpi y se mantuvo elevada hasta 180 dpi (Figura 3 y 4). Similares a los macrófagos / microglia, las células T infiltración se prevé que pico 7 dpi ^5-7, sin embargo, la citometría de flujo no se detectaron cambios en el número de células T en los primeros 7 dpi, aunque un número elevado de células T se detectó a las 9 dpi (1,6%) (Figura 4). Mientras que las células T número estaba disminuyendo en un 10 dpi, una persistente respuesta de células T se observó a través de 180 dpi, momento en el que el 4,4% de las células fueron marcadas para CD3 (Figura 4).

En conjunto, estos datos demuestran una respuesta multifásica en función del tiempo de la inflamación celular después de la lesión (Figura 4), las fases iniciales de la inflamación celular se compone de la cumbre a principios de los PMN 1 ppp seguido de un pico de ED1 + macrófagos / microglia 7 dpi y T -celdas 9 dpi, mientras que las fases posteriores se compone de las tres poblaciones celulares en aumento después de 14 dpi y persistentes a través de 180 dpi, con un pico notable segundo de los macrófagos / microglia a 60 dpi. Este estudio timecourse y los datos cuantitativos generados por citometría de flujo se han validado con anterioridad, que muestra resultados comparables a los datos obtenidos de estereología cuantitativa de immunolabeled secciones de la médula espinal ^1.

Tabla 1. Preparación de gradiente OptiPrep para la eliminación de restos de mielina. Cuatro soluciones gradiente OptiPrep se realizan con HBSS y se diluye OptiPrep (1:1 dilución de OptiPrep y MOPS).

Figura 1. Densidades OptiPrep gradiente más separados mielina / restos de la médula espinal lesionada tejidos / células y mejorar la evaluación de células inmunes por citometría de flujo. (A) La mielina / basura se separa de las células (neuronas, células gliales y células del sistema inmune) después de la centrifugación del tejido disociado de la médula espinal a través de un gradiente de OptiPrep seguida de aspiración de la capa de mielina / escombros. (B) PMN número en la médula espinal lesionada, que muestra una mayor sensibilidad en la detección de los PMN después de la remoción de escombros (Student t-test, p = 0,0001). Todas las puertas de citometría de flujo se ajusta con células marcadas de animales ilesos, n = 5 por grupo, con una media ± SEM. 5.000 eventos por muestra se lee en todas las muestras y los valores medios de las células de forma positiva la etiqueta se expresaron como porcentaje (± SEM) de toda la muestra.

Figura 2. La detección de la infiltración de PMN en la médula espinal lesionada por citometría de flujo. Después de una contusión moderada (200 kd) en T9, PMN entró rápidamente en la médula espinal a partir de 2 horas (B) después de la lesión y en horas pico 1 ppp (C). Todas las puertas de citometría de flujo se ajusta con células marcadas de animales lesionados (A).

Figura 3. Detección de los macrófagos / microglia en la infiltración de la médula espinal lesionada por citometría de flujo. Después de una contusión moderada (200 kd) en T9, ED1 + macrófagos / microglia mayor número en la médula espinal lesionada a partir de 3 dpi (D), alcanzó su punto máximo aguda a los 7 dpi (E), se redujo a niveles bajos a los 14 dpi (F) , antes de subir a un segundo pico a los 60 dpi (G), y se mantuvo en la médula espinal lesionada de hasta 180 dpi (H). IgG etiquetado de control de isotipo de las células de la columna vertebral 7 dpi (B) mostró un mínimo de anticuerpos etiquetado de fondo y no hay diferencia de las células marcadas con anticuerpos de 2 horas después de la lesión (C) o no lesionado animales (A). Todas las puertas de citometría de flujo se ajusta con células marcadas de animales ilesos.

Tabla 2. Muestras de animales en experimentos timecourse. Para cada punto del tiempo (0 horas a 180 dpi), cinco animales recibieron una moderada (200 kd) contusión en la T9,y los tejidos de médula espinal fueron evaluados por citometría de flujo para el número de PMN, macrófagos ED1 ⁺ / microglia, y CD3 ⁺ células-T. Sin embargo, no todas las muestras de los animales fueron recuperados con éxito de PMN (4-5), ED1 (3-5), y CD3 (4-5) el flujo de los análisis de citometría.

Figura 4. Un timecourse de la inflamación celular en la médula espinal después de una contusión moderada (200 kd) en T9. Según la evaluación realizada por citometría de flujo, el número de PMN, macrófagos ED1 ⁺ / microglia, y CD3 ⁺ células T alcanzó aguda (1,7 y 9 dpi, respectivamente) y se mantuvo de forma crónica en la médula espinal lesionada. N = 3 al 5 por grupo, la media ± SEM.

Discusión

El uso de la citometría de flujo para cuantificar las células inmunes en el SNC se ve complicada por el contenido de lípidos / mielina y los escombros. Además de interferir con la unión de los anticuerpos y la especificidad, los restos de mielina puede tener el tamaño y propiedades similares a las células inmunes de granulación, la disminución de la sensibilidad y la precisión de medición ^8. La célula novedoso método de preparación se describe aquí es eficaz en la eliminación de restos de mielina y por lo tanto mejora la sensibilidad de la citometría de flujo para detectar cambios en la inflamación celular en la médula espinal lesionada. Por ejemplo, la eliminación de restos de mielina por este método de detección mejorada de células del sistema inmune frente a la disociación enzimática alone.Critically, el uso novedoso de este método permitió la primera caracterización de la inflamación celular agudo y crónico después de la lesión para incluir un curso a tiempo completo para los PMN, macrófagos / microglia y las células T de hasta 180 dpi, e identificó una fase de la segunda novela de la inflamación celular. Estos importantes hallazgos de un componente multifásica de neuroinflamación puede ser fundamental para el diseño e implementación de estrategias racionales de tratamiento terapéutico, incluyendo tanto las intervenciones basadas en células y farmacológicos para el SCI.

El sistema de gradiente OptiPrep se ha utilizado para los residuos por separado a partir de células en la sangre de ^9, o las neuronas del cerebro purificar para fines de cultivo de células de ^10, sin embargo, se ha modificado y avanzado sistema de este método para separar los residuos de mielina de las células de la médula espinal disociada, y permitió cuantificación rápida y más precisa de la inflamación celular por citometría de flujo. Este método, junto con la citometría de flujo es probable que proporcione un avance significativo en la investigación de la inflamación después de lesiones del SNC o estados patológicos, como la mayoría de los estudios sólo han caracterizado la inflamación celular en el SNC mediante técnicas morfológicas e histológicas que no son del tipo de células específicas o no siempre puede proporcionar información verdadera evaluación cuantitativa. Además, algunos estudios recientes han intentado cuantificar las células inmunes de la médula espinal lesionada por citometría de flujo utilizando tejido fresco cable disociada ^11,12 o células separadas por el gradiente de Percoll sistema de ^13, sin embargo, estos estudios han demostrado tanto los rendimientos celulares de baja o insensible detección de las células inmunes.

En cambio, el gradiente de OptiPrep células método de preparación ha dado por primera vez, la evaluación cuantitativa sensible y fiable mediante citometría de flujo a los cambios de la inflamación celular en respuesta a la gravedad de las lesiones clasificadas y más de un timecourse extendido hasta 180 dpi. La sensibilidad y fiabilidad de los análisis de citometría de flujo también depende de la especificidad de los anticuerpos utilizados para detectar determinados tipos de células inmunes, como la citometría de flujo no permite que los criterios morfológicos para diferenciar aún más los tipos de células. La especificidad de los anticuerpos de los PMN, macrófagos / microglia o T dice-ha sido probado a fondo en la citometría de flujo para los PMN peritoneal y macrófagos alveolares en la cultura y las células de la lesión espinal ^1,2 tejido de la médula. Junto con el sistema de gradiente OptiPrep, estos anticuerpos utilizados para la citometría de flujo han contribuido a la generación de un análisis temporal y cuantitativa de la inflamación celular que ha proporcionado nueva comprensión de la dinámica del microambiente SCI, y se identificaron por primera vez una respuesta multifásica extendida de la inflamación celular. Esta respuesta multifásica de las células después de la lesión puede ser importante para investigar el papel de determinados tipos de células presentes en determinados momentos después de la lesión o generar intervenciones terapéuticas contra determinados tipos de células que pueden agravar las lesiones. Además, estos hallazgos pueden ayudar en el desarrollo de una lógica adecuada para las intervenciones óptimas de drogas o célula de base para el DME.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
OptiPrep	Fisher Scientific	NC9182490
HBSS	Sigma	H1387
Conejo anti-rata PMN (FITC)	Química exacta y científica	AIFAD51140
Ratón anti-rata ED1 (Alexa Fluor 488)	AbD Serotec	MCA341A488
Ratón anti-rata CD3 (FITC)	AbD Serotec	MCA772F
Tripsina	Sigma	T9935
Colagenasa	Sigma	C5138
DME	Sigma	D1152
IgG1 de ratón (Alexa Fluor 488)	AbD Serotec	MCA1209A488
De suero fetal bovino	Hyclone	SH30070.03
Suero de conejo	Jackson ImmunoResearch	011-000-120011-000-120
Suero de ratón	Jackson ImmunoResearch	015-000-120
Filtro celular	BD Falcon	352340